李绍戊 王 荻 冯 娟 卢彤岩①

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 哈尔滨 150070;2.中国水产科学研究院南海水产研究所 广州 510300;3.农业部南海渔业资源开发利用重点实验室 广州 510300)

鲟鱼(Acipenseriformes)属世界性保护物种(谢忠明等,2002)。随着鲟鱼养殖关键技术的完善,鲟鱼养殖产业得到快速发展。我国试养的鲟多达十几种,目前形成规模养殖的种类主要有施氏鲟(Acipenser schrenckii)、西伯利亚鲟(Acipenser baerii)、鲟鳇杂交(Huso dauricus♀×Acipenser schrenckii♂)和 匙 吻 鲟(Polyodon spathula),约占鲟养殖总产量的 90%以上(孙大江等,2011)。但受到集约化程度快速提高、养殖水体污染严重、病害防治技术落后等诸多因素影响,养殖鲟鱼爆发性疾病日趋严重,给生产及科研工作造成巨大损失和困扰(田甜等,2012)。

水产动物耶尔森菌病(yersiniosis)是由肠杆菌科耶尔森菌属的鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)引起的,该菌可导致鲑鳟鱼类发生肠炎红嘴病(enteric redmouth,ERM),其主要症状为体表(尤其是头、嘴、鳃盖等部位)充血、肠道肿胀发炎等(Furoneset al,1993;Tobbacket al,2007)。研究表明,鲁氏耶尔森菌主要为冷水性鲑鳟鱼类的病原菌,但同样感染其他鱼类如鲢、鳙、鳗、金鱼、鲤鱼、鲟鱼和罗非鱼等,并导致鱼类细菌性败血症,可同其他革兰氏阴性菌如嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌等混合感染(Bercet al,1999;Danleyet al,1999;Eissaet al,2008)。在国内,徐伯亥等(1991)、范芳玲等(2010)先后报道了由鲁氏耶尔森菌引起的鱼类细菌性败血症,病鱼体表多处出血,内脏伴有不同程度的发炎、充血。Vuillaume等(1987)首次从西伯利亚鲟中分离到鲁氏耶尔森菌,病鱼表现为嘴部、下颌、胸鳍及泄殖孔附近出血,并伴有腹水。2010年作者在河北某鲟鱼养殖场进行流行病学调查发现一例施氏鲟出血症,症状与已报道的耶尔森菌病相近,对发病鲟鱼进行了病原分离鉴定,并进一步确定了病原菌的致病性。为了明确病原菌的分类学地位,本文采用生理生化方法和16S rRNA基因序列分析方法鉴定致病菌,并进行系统发育学分析。另外,通过感染鲁氏菌后鲟鱼病理组织切片观察,来了解鲁氏耶尔森菌对鲟鱼的致病机理和感染途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

鱼源鲁氏耶尔森菌分离株(YR-H01)于2010年分离自河北某鲟鱼养殖场患病鲟鱼体内;实验用施氏鲟购自中国水产科学研究院北京房山鲟鱼繁殖中心,为非免疫状态下(60±2)g实验鱼;实验用TSA/TSB培养基、PCR所用试剂及特异性引物均购自上海生工生物工程有限公司;细菌基因组 DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司;细菌生化微量鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌形态观察及理化特征鉴定 室温下解冻低温冷冻保存的菌种,在无菌条件下,将细菌接种于TSA平板上,25°C恒温培养24h。肉眼观察菌落形态、大小、隆起度、颜色等,并利用透射电镜(Hitachi-7650)观察细胞的形态及鞭毛数量等;菌株各项生化指标的测定参照相关文献进行(东秀珠等,2001)。

1.2.2 人工感染实验及 LD50测定 将分离菌株YR-H01接种TSA于25°C恒温培养24h后,用10mL pH 7.2的灭菌生理盐水洗板,振动摇匀,稀释至合适浓度备用。选取适当的稀释系数,按照攻菌浓度从高到低依次设立A—H共8个实验组,同时设立注射等比例生理盐水的对照组Z进行摸索LD50实验。每组随机选取施氏鲟6尾,按照0.2mL/50g体重腹腔注射不同浓度菌液,分别于24h、48h及 72h后观察记录死亡情况及病理症状,同时按Reed-Muench法计算菌株半致死量(LD50)(Reedet al,1938)。

将鲁氏菌稀释至 LD50浓度并进行攻毒实验,每组10尾,设空白对照组。剖检实验组死亡施氏鲟,观察鱼体内主要脏器的病理变化,并对72h仍存活的鲟鱼取血及实质器官肝、肾进行细菌分离计数,同时对其肝、肾组织进行组织病理学检验。

1.2.3 16S rRNA序列测定及系统发育分析 将细菌接种于TSB中,25°C 220r/min震摇18h后离心收集菌体,按照细菌基因组 DNA提取试剂盒说明书提取细菌总DNA,作为PCR模板DNA。参考文献,利用特 异性 引 物 Yer-F:5’-CGAGGAGGAAGGGTT AAGT-3’和 Yer-R:5’-AAGGCACCAAGGCATCTCT-3’对鲁氏菌 16S rRNA 基因片段进行扩增(Cunninghamet al,2010)。PCR反应条件为:95°C预变性5min;94°C 变性 30s,55°C 退火 30s,72°C 延伸 1min,共 30个循环;最后 72°C延伸 10min。PCR产物经纯化后由上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。

利用 BLAST 在线同源性查询软件查询所测菌株 YR-H01的 16S rRNA序列的属性,将其与从GenBank数据库中获得的耶尔森菌属细菌及其他亲缘关系相近的属种的16S rRNA,采用Clustal W软件进行多序列匹配排列(Multiple Alignments),用系统发生推断软件包 MEGA 4.0 进行系统发育分析。在Kimura-2-parameter模型的基础上,用 Neighborjoining法构建分子系统树,自举分析(Bootstrap)1000次重复检测分子系统树的置信度,缺失和不确定的位点在计算中被省略。

2 结果

2.1 发病病例的流行情况及临床特征

2010年 3月作者在河北省某鲟鱼养殖场进行流行病学调查发现一例鲟鱼出血症,死亡率达到30%。养殖模式为水泥池流水养殖,发病水温约 12—16°C,发病个体大小约300—500g。同时间在河南、北京周边地区主要鲟鱼养殖场也发现类似病症,死亡率从10%至50%不等;结合近几年的鲟鱼主要病害流行病学调查工作,初步判断为细菌性出血症。病鱼临床症状表现为下颌、胸鳍、腹部及泄殖孔附近出血,并伴有腹水。解剖观察发现病鱼内脏器官有不同程度的出血,肝脏肿大、发暗,有出血点或出血斑,心脏呈花斑状,脾脏紫黑色,肠道不同程度出血。

2.2 细菌形态特征

鲁氏耶尔森菌YR-H01株在25°C培养24h后于TSA平板上形成表面光滑、边缘整齐、微粘、淡黄色,直径约1—2mm的圆形隆起的菌落。革兰染色后镜检发现该菌株为革兰氏阴性短杆菌(图1a)。透射电镜结果显示,YR-H01株胞外有一层明显的细胞膜,伴有褶皱。细胞直径约 0.64μm,长度在1.7—2.5μm,细胞膜的厚度为0.12μm。每个细胞有5—8条周生鞭毛并锚定在细胞上(见图1b)。

图1 鲁氏耶尔森菌YR-H01株形态观察Fig.1 Morphological images of Y.ruckeri YR-H01

2.3 理化特征

常规理化分析表明,YR-H01株革兰染色阴性,氧化酶反应阴性,氧化发酵阳性,具有运动性;其他理化特征见表1。生长条件测定结果显示,YR-H01株生长温度范围为 20—37°C,最适生长温度为25—30°C,在含盐量 1%—3%的 TSA 培养基上能生长,生长的pH值范围为5.0—9.0,最适pH值为7.0,且在28°C培养18h后细菌数目达到稳定期(图2)。

表1 YR-H01菌株的生理生化特征分析Tab.1 Characteristics and biochemical reactions of the YR-H01 isolate

图2 鲁氏菌YR-H01株最适生长条件研究Fig.2 The optimum growth condition of Y.ruckeri YR-H01 strain

2.4 16S rRNA基因序列和系统发育学分析

PCR扩增YR-H01菌株的16S rRNA基因片段约500bp,测序结果表明该片段有 563bp,在 GenBank中的登陆序列号为 JQ657818。同源性检索结果表明YR-H01菌株与耶尔森菌属的鲁氏耶尔森菌、克里斯坦森耶尔森菌以及小肠结肠炎耶尔森菌核苷酸同源性达到96.5%以上。

从NCBI核酸数据库中选取16个水产动物致病菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育学分析,结果如图3所示,YR-H01与Y.ruckeri(HQ222844)、Y.kristensenii(NR025159)、Y.enterocolitica(NR041832)和Y.intermedia(NR027545)聚成一群,与它们的相似性分别达到98.5%、97.5%、96.4%和96.8%;另外,与爱德华菌属的迟缓爱德华菌、斑点叉尾爱德华菌遗传距离较近,而与黄杆菌亲缘关系较远。综合常规生理生化和16S rRNA基因序列分析结果表明,YR-H01株鉴定为鲁氏耶尔森菌。

2.5 LD50的测定及临床观察结果

当注射 0.2mL浓度为 1.5×108CFU/mL的菌液后,试验鱼的累积死亡率达到 100%;因此,确定分组区间为(0—3)×107CFU,所用稀释倍数为 1.5。根据Reed-Muench法计算 YR-H01菌株半致死量(LD50)为7.2×106CFU(表2)。

经观察发现,鲟鱼感染鲁氏耶尔森菌后,肛门红肿外突明显,且部分鱼鳍基部和下颌处有出血现象。随着攻菌浓度的升高,出现临床病理症状的时间逐渐缩短,实验A组6h开始有部分鱼出现病理症状,8h症状普遍出现,9h第一尾鱼死亡,对照组无死亡记录。

图3 基于16S rRNA基因序列的系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic relationship among Yersinia species based on 16S rRNA gene sequences

表2 人工感染不同浓度YR-H01株后试验鱼的死亡数量统计Tab.2 The cumulative mortality of fish injected with different concentrations of Y.ruckeri H01

对实验组感染后死亡鲟鱼进行剖检可见,其肠道充血,肿胀,肠道内充满黄色液体,部分鱼有粘性分泌物。取对照组及感染后存活鲟血及肝、肾涂板进行细菌分离计数,结果表明:对照组三种组织中均未分离到鲁氏菌,而实验组肝、肾带菌率为100%,且生化鉴定和分子鉴定结果表明重新分离到的菌株与感染的鲁氏菌YR-H01株一致;血液未见细菌检出。

2.6 病理组织观察

由肝肾组织切片结果可见,感染后鲟鱼肾脏无明显病变(图4a),肾细胞形状及大小均正常,肾小管管腔形状清晰可辨,无淋巴细胞及血细胞侵染,且管腔上皮细胞界线清晰,排列规则。对照组鲟鱼肝脏组织切片(图4b)观察结果表明,对照组肝脏组织致密、结构清晰,具有完整的肝索、肝血窦等结构,肝细胞排列紧密,核呈圆形,位于细胞中央,细胞质饱满,且细胞间窦状隙明显,其中充满红血球。而感染鲁氏菌的鱼肝组织出现明显的淋巴细胞侵润(图4c),肝细胞的索状结构消失,肝组织呈弥漫性坏死,肝细胞肿胀,肝细胞基本上失去了正常的多角形形状,核空泡变性或核仁移向边缘(图4d)。有些肝细胞已经溶解变性,窦状隙腔已弥散不可见。

3 讨论

鲁氏耶尔森菌是冷水性鲑鳟鱼类、温水性鲤科鱼类等的常见病原菌之一。自上世纪50年代首次在美国养殖虹鳟体内分离到该菌以来(Rosset al,1966),其宿主范围和地理分布均有明显地扩大趋势,其感染鱼类主要包括鲑鳟科鱼类、金鱼、鳗鲡、鲽鱼、鲟鱼、鲢鱼、鳙鱼、斑点叉尾等,且在德国、法国、英国等欧洲各国及澳大利亚、中国均有所发现(Austinet al,2007),已成为对养殖鱼类具有广泛致病性的重要病原菌之一。本实验首次从我国鲟鱼主养区患出血症的鲟鱼体内分离、保存了鲁氏耶尔森菌一株,命名为 YR-H01株,结合目前对鱼类病原菌的鉴定方法,从形态观察、理化特征分析及基因序列比对分析等方面对其进行研究(Nomotoet al,2004;孟彦等,2007;甘西等,2007),结果显示YR-H01株的理化特征与已报道的斑点叉尾(Ictalunes punctatus)源菌株基本一致(范芳玲等,2010)。攻毒后,实验鱼有明显出血症状,且可从发病鱼的内脏组织再次分离到与原感染菌特性相同的致病菌株,确定该菌对施氏鲟具有致病性。而电镜观察菌株形态与Austin等(1999)报道的鲁氏耶尔森菌基本一致。

图4 鲁氏耶尔森菌感染施氏鲟肝肾病理变化Fig.4 Pathological changes of livers and kidneys in Amur sturgeon after infection by YR-H01 strain

不同环境条件对细菌感染力有一定影响,而鲁氏菌感染受温度影响较大。15—18°C水温对细菌感染有明显影响(Roberts,1983);斑点叉尾鮰腹腔注射鲁氏菌时,18°C感染及发病率远高于22°C(Danleyet al,1999),表明较低水温可增加鲁氏菌致病性,加重感染程度(Fernandezet al,2007)。华北、东北地区是我国鲟鱼人工繁育、苗种孵化的主要场所,这些地区多为温冷水性养殖区,水温 18—24°C 期间较长,需加强鲁氏菌低温易感菌的监控和监测工作。

随着鲟鱼养殖的产业化发展,因管理手段、养殖环境及水产品贸易等,导致病原传播几率大大增加,为鲁氏耶尔森菌在鲟鱼养殖地区的迅速传播创造了条件,使该菌对鲟鱼的潜在危害性增大。上世纪九十年代我国黑龙江、山东、北京等鲟鱼主养区多次暴发发病急、发病率和死亡率高的不明疾病。1997至2000年间累计死亡鱼苗约 30万尾,死亡率高达 80%。病鱼体侧、腹部、鳃等部位出血,个别严重者可见吻部及口腔周围出血;剖检可见,肝、脾、肠道等有出血现象。组织病理研究表明患病鱼肝组织病变严重,局部肝细胞坏死(曾朝辉,2003)。患病鱼体表及内脏组织大面积出血、肝损伤及神经症状与鲁氏菌病症有许多相似之处。目前,鲟鱼感染鲁氏菌的报道较少,但危害极大,可导致60%以上的死亡率(Vuillaume et al,1987)。

近几年,我国养殖鲟鱼流行病学调查研究发现,每年 4—8月是耶尔森菌病的发病高峰期,其发病频率及程度受温度、水质等环境因子及鱼体自身免疫力等因素的影响。因此,在鲟鱼养殖过程中应加强对该细菌病的监控工作,从水质控制、养殖密度等方面预防疾病,以便及时采取有效的防治措施,避免该菌成为养殖鲟鱼未来重要新病原的可能,并可适当选用喹诺酮类药物进行早期防治,建立控制鲟鱼耶尔森菌病的有效方法。

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