赵萱，傅超美，徐晓秋

·炮制制剂·

大孔树脂纯化丹参总酚酸的研究

赵萱，傅超美，徐晓秋

目的：确立大孔树脂纯化丹参总酚酸的最佳纯化工艺。方法：以静态吸附率和解吸率为考察指标，确定大孔树脂型号，并确定纯化工艺参数。结果：选择HPD-400型号大孔树脂用于丹参总酚酸的纯化工艺，最佳吸附工艺条件为：上样吸附流速为2BV/h，上柱液的浓度为0.5 g生药/mL，pH值为4；解析前，以3BV的水洗脱除杂，最佳解析工艺条件为：选择乙醇为洗脱剂，洗脱剂浓度为40%，pH值为5，控制解析流速为3BV/h。结论：所建立的方法简便、准确，可用于丹参总酚酸的纯化。

丹参总酚酸；大孔树脂；纯化工艺

大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂。大孔吸附树脂具有比表面积较大、交换速度较快、吸附量大、解吸和再生容易等优点，近几年在天然产物的分离纯化中被广泛应用，本文采用大孔吸附树脂进行分离提纯处理，并对分离提纯条件进行了详细的研究。

1 材料

中江丹参(产地：四川中江，经鉴定符合《中国药典》2010年版一部53页“丹参”项下相关要求，购于成都西南药都药材市场)，原儿茶醛对照品(中国药品生物制品检验所，批号810-200004)。HPD-100，HPD-200A，HPD-400，HPD-500，HPD-700树脂(河北沧州宝恩化工有限公司)，盐酸，乙醇，甲醇，十二烷基磺酸钠，铁氰化钾，三氯化铁等试剂试药均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

取丹参药材2500g，浸泡30分钟，10倍量水，提取2次，每次提取1.5h，第一次加水时补足吸水率200%，提取液滤过，滤液浓缩至1 g生药/mL，静置过夜，滤过，滤液作为上样液。

测定丹参总酚酸含量及溶液的总体积，相关的实验数据见下表1。

表1 上样液制备相关数据表

2.2 大孔树脂型号的筛选[4]

选用沧州宝恩公司HPD系列大孔吸附树脂进行试验，以树脂静态吸附量、解吸率等为评价指标，对树脂型号进行筛选。

（1）树脂静态吸附量的考察

称取经预处理后的7种大孔树脂5g（以干树脂计）至250mL锥形瓶中，分别加入上样液50mL，静置24小时，滤过，以原儿茶醛为对照品，用紫外分光光度法测定滤液中丹参总酚酸的含量，计算各干树脂的静态吸附容量和吸附率。实验结果见表2。

表2 各型号大孔树脂的吸附容量

由以上静态吸附容量实验可见，中等极性的HPD-400树脂以及极性树脂HPD-500、HPD-600的吸附容量效果明显优于其他树脂，与丹参酚酸类物质含酚羟基属中等极性化合物的性质一致，因而选取这三种树脂，进一步考察其解吸率。

（2）树脂解吸率的考察

将上述吸附饱和的大孔吸附树脂，用水洗至水洗液无色，去除树脂表面残留的溶液，各树脂分别依次用30%、50%、60%、70%、90%乙醇浸泡洗脱2次，每次10 mL、每次浸泡2h、每1h超声振摇5min。收集各不同乙醇浓度的洗脱液。以原儿茶醛为对照品，用紫外分光光度法测定各洗脱液中丹参总酚酸剩余量和解吸量，计算解吸率。实验结果见表3。

表3 三种HPD树脂的吸附与解吸情况

实验结果表明，HPD-400大孔树脂与其余两种树脂相比，具有较高的的吸附量与良好的解吸率，故选择HPD-400型号大孔树脂用于丹参总酚酸的纯化工艺研究。

2.3 大孔树脂吸附条件的筛选

以吸附流速、上柱液浓度、上柱液酸碱度三个方面对树脂吸附曲线的影响，确定大孔树脂吸附纯化工艺的最佳参数。

（1）上样液浓度对树脂吸附量的影响

取丹参静置滤过除杂后的提取液，调节浓度分别为0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 g生药/mL，取各浓度丹参上样液50mL，加入预处理好的HPD-400大孔树脂5mL，静态吸附过夜，吸附完成后分离出上清液，以原儿茶醛为对照品，用紫外分光光度法测定剩余上清液中丹参总酚酸含量。结果见表4。

表4 上样液浓度对树脂吸附量的影响

结果表明，当上样液浓度在0.5～0.7 g生药/mL时，大孔树脂对丹参总酚酸的吸附率较高，考虑生产成本与便于控制，确定上样液浓度为0.5 g生药/mL。

（2）上样液pH值对树脂吸附量的影响

取浓度为0.5 g生药/mL的上样液，调节pH值分别为2、4、6、8、10，取各pH值的丹参上样液50mL，加入预处理好的HPD-400大孔树脂5mL，静态吸附过夜，吸附完成后分离出上清液，以原儿茶醛为对照品，用紫外分光光度法测定剩余上清液中丹参总酚酸含量。结果见表5。

表5 上样液pH值对树脂吸附量的影响

结果表明，上柱液pH值为4时，树脂的吸附效果最佳，且符合该型号大孔树脂使用的pH值范围，故确定上柱液的pH值为4。

（3）吸附流速的考察

选用3根同样的树脂柱，量取5mL树脂，湿法装柱，径高比约1: 6。取丹参上柱液（浓度0.5 g生药/ mL，pH=4），提取液通过树脂柱的流速分别为1BV/ h，2 BV/h，3 BV/h，室温。分批收集流出液，每流出2BV，即2倍树脂体积收集一份。以原儿茶醛为对照品，用紫外分光光度法测定每份流出液中丹参总酚酸的含量，计算每份流出液中丹参总酚酸的泄漏率，并对流出液的标号作树脂动态曲线。当流出液中丹参总酚酸的泄漏率为10%时，计算此时树脂的吸附量。

根据以上实验结果，结合生产效率，确定上样流速为2BV/h。

2.4 大孔树脂洗脱条件的筛选

（1）洗脱溶剂的选择与洗脱剂用量的确定

本实验选用乙醇作为洗脱剂，并对乙醇浓度进行考察。

选用3根同样的树脂柱，量取5mL树脂，湿法装柱，径高比约1:6。取丹参上柱液（浓度0.5 g生药/mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，动态吸附饱和后，分别依次用水和乙醇洗脱，控制洗脱流速为3BV/h，室温条件下，水洗液每1BV收集一份，共收集6份，测定每份水洗脱液的总固体量，以编号为横坐标绘制水洗脱杂质曲线。乙醇洗脱液每1BV收集一份，共收集6份，测定每份中洗脱液丹参总酚酸的量,以每份洗下的总酚酸量为纵坐标，以编号为横坐标绘制洗脱曲线。实验结果见表6、表7。

表6 水洗脱液的总固体量

由水洗脱曲线可知，水用量为3BV时，基本达到最大杂质洗脱量，确定水洗脱量为3BV。

选用3根同样的树脂柱，量取5mL树脂，湿法装柱，径高比约1: 6。取丹参上柱液（浓度0.5 g生药/ mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，动态吸附饱和后，用乙醇洗脱，控制洗脱流速为3BV/h，室温条件下，洗脱液每1BV收集一份，共收集6份，测定每份中洗脱液丹参总酚酸的量，以每份洗下的总酚酸量为纵坐标，以编号为横坐标绘制洗脱曲线。

表7 丹参总酚酸的乙醇洗脱量

由丹参总酚酸的乙醇洗脱曲线可知，乙醇用量为4BV时，基本达到最大丹参总酚酸洗脱量。三种不同浓度的乙醇洗脱效果，以40%较好。故最终确定洗脱溶剂为40%乙醇，洗脱剂用量为4BV。

（2）洗脱剂pH值的确定

取4份己知吸附量的饱和吸附湿树脂各5 mL，分别加入pH=4, 5, 6, 7的40%的乙醇各20mL，超声振荡10min后再室温静置12h，测定解析液中丹参总酚酸的含量，计算解析率。实验结果见表13。

表8 洗脱剂pH值对树脂静态解析的影响

根据试验结果，最终确定洗脱剂pH值为5，即洗脱溶剂为pH=5的40%乙醇。

（3）洗脱流速的确定

选用3根同样的树脂柱，量取5 mL树脂，湿法装柱，径高比约1: 6。取丹参上柱液（浓度0.5g生药/mL，pH=4）以2 BV/h的流速上柱，动态吸附饱和后，3BV的水以3BV/h的流速洗脱，水洗脱杂质后，以4BV 的pH=5的40%乙醇为洗脱剂，控制洗脱剂通过树脂柱流速分别为3BV/h、4BV/h、5BV/h，室温条件下，洗脱液每0.5 BV收集一份，测定每份洗脱液中丹参总酚酸含量，绘制树脂动态解析曲线，比较洗脱效果，选择最佳洗脱流速。实验结果见表9。

表9 不同流速下丹参总酚酸的乙醇洗脱效果

根据试验结果，流速为3BV/h时总洗脱率最高，综合考虑解析曲线的峰值、收敛性及生产效率，确定3BV/h流速为最佳洗脱流速。

综合以上研究，最终确定大孔树脂纯化丹参总酚酸的工艺参数为：选择HPD-400型号大孔树脂用于丹参总酚酸的纯化工艺，最佳吸附工艺条件为：上样吸附流速为2BV/h，上柱液的浓度为0.5 g生药/ mL，pH值为4；解析前，以3BV的水洗脱除杂，最佳解析工艺条件为：选择乙醇为洗脱剂，洗脱剂浓度为40%，pH值为5，控制解析流速为3BV/h，以上吸附和解析均在室温下进行。

2.5 验证试验

按确定的上述工艺条件，做3次重复试验，结果见表10。

表10 验证试验结果

由以上重复性实验可知，该大孔树脂的除杂工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 实验中常用水提法提取丹参中总酚酸，水提取液中杂质较多，如无机盐、蛋白质、糖、鞣质等，使得到的水提取液中丹参总酚酸的浓度较低。为了提高提取液中酚酸类物质的浓度，常采用醇提水沉淀法、吸附澄清法、高速离心法、超滤法等方法进行分离纯化处理。但这些操作往往具有有效成份损失较高、生产周期长、分离处理成本高等缺点。大孔吸附树脂具有吸附量大、解吸和再生容易等优点，现广泛应用于中药行业中，本文试验结果表明，其可用于丹参总酚酸的分离纯化。

3.2 树脂洗脱试验中，常用的洗脱剂有乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等，为减少对产品刺激性的影响及保护环境，本实验选用乙醇作为洗脱剂，丹参总酚酸主要集中在30%乙醇洗脱液中，50%洗脱液中虽然有一定量，但总酚酸的含量明显偏低，而70%～90%洗脱液中几乎不含丹参总酚酸，由此可预测，乙醇的洗脱浓度范围应在30%～50%范围内，进而采用动态洗脱方法，确定了乙醇的最佳浓度。

[1] 李广胜,王光新,赵牛和.丹参口服液中总酚酸性成分的含量测定[J].时珍国医国药,2001,12(8):683.

[2] 曹冬,黄喜茹等.丹参及丹参制剂中水溶性酚酸总量的测定[J].世界科学技术——中医药现代化.中药制剂研究,2005,7 (4):67.

[3] 李广胜,王光新,赵牛和.丹参口服液中总酚酸性成分的含量测定[J].时针国医国药,2001,12(8):683.

[4] 袁海龙,李仙义,等.D-101型大孔树脂残留物的顶空进样法分析研究[J].中药新药与临床药理,2003,14(2):121.

（责任编辑:胡慧玲）

Purifcation of Total phenolic acid of Danshen by macroporous resin

Objective:To establish the purification technology of Total phenolic acid of Danshen by macroporous resin. Method: Static adsorption rate and desorption rate were taken as indexs to optimize the type of macroporous resin and purifcation technology parameters. Result: The HPD-400 macroporous resin was chosen in the purifcation technology of Total phenolic acid of Danshen. Optimum adsorption technological conditions were as following: The adsorption rate was 2BV/h. The concentration was 0.5 g raw drug/mL with pH of 4. 3BV water was used to elute impurity before desorption. Optimum desorption technological conditions were as following: Eluted with 40% ethanol aqueous at the fow rate 3BV/h, and pH was 5. Conclusion: The method is simple，accurate，specifc and can be applied in the purifcation of Total phenolic acid of Danshen.

Total phenolic acid of Danshen; macroporous resin; purifcation technology

R 283.6

A

1674-926X(2014)01-005-04

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

赵萱（1986-），女，四川德阳，硕士研究生，助教，研究方向：中药新制剂和新剂型的研究Email:626098860@qq.com

傅超美（1961-），男，四川简阳，教授，博导，研究方向：中药新制剂和新剂型的研究Email:chaomeifu@126.com

2013-10-22

ZHAO Xuan, FU Chao-mei, XU Xiao-qiu//(Pharmacy College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine;State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China)