张惜燕 田丙坤 陈传贞 邢玉瑞 乔文彪 李翠娟 李 涛 孙耀光陕西中医学院(西安712046)

1 研究背景 成骨细胞在体内合成分泌胶原、糖蛋白等类骨质成分，参与类骨质的钙化，是体内参与骨形成过程的主要功能细胞，是开展体外成骨细胞实验的主要细胞来源［1］。近年来，越来越多的学者通过体外分离培养成骨细胞开展实验研究，取得了很大的成绩［2］。但是因为骨组织特殊的生理结构，培养成骨细胞难度大，在实际培养中常表现出细胞数量少、纯度差及细胞功能缺失等问题。本实验旨在寻求科学的大鼠成骨细胞原代培养方法，为研究成骨细胞的功能及其在骨形成中的作用提供最佳的体外实验模型。

常用的成骨细胞体外培养方法有两种。组织块培养法是将骨组织剪成适当大小的组织块，培养骨组织，利用成骨细胞在体外可移行出骨组织的特点，收集爬行出的成骨细胞进行研究的方法。此法的特点是无需酶消化处理、对细胞损伤小，但细胞产出率低、培养周期长［3］。另一种方法是酶消化法。原始的酶消化法中胰蛋白酶消化时间难以掌握，容易损伤细胞及胞膜上的功能蛋白，影响细胞存活及功能［4］。因而本研究选择改良的胰蛋白酶和I型胶原酶联合的酶消化法来获取大鼠成骨细胞。骨组织细胞外基质(ECM)的有机成分中90%由I型胶原构成，胶原酶的作用相对温和，对细胞损伤较小［5］，实验中对两种酶的消化温度及消化时间进行严格控制，所得细胞沉淀均经PBS冲洗后种瓶，极大地避免了酶消化法对细胞膜表面受体和抗原成分的损害。

2 材料与方法 2．1 实验材料 ① 动物:SPF级48h新生SD大鼠6只，雌雄各半。购自西安交大医学动物实验中心。实验动物质量合格证编号:0014342。②试剂:0．25%胰蛋白酶(solarbio北京索莱宝科技有限公司)，Ⅰ型胶原酶(sigma上海根生生物科技有限公司)，胎牛血清(北京全式金生物技术有限公司)，DMEM培养液(solarbio北京索莱宝科技有限公司)，PBS缓冲液，75%酒精。③ 主要实验仪器:CO2培养箱(德国宾德binder)，医用低温冰箱(MDF-330，日本)，全自动高压灭菌器(日本三洋MLS-3788)，高速低温离心机(美国thermo)，电热恒温震荡水槽(上海一恒科学仪器有限公司DKZ系列)，超净工作台(泰斯特CJ-2D)，倒置生物显微镜(Olimpubs)。

2．2 成骨细胞的分离 出生48h内的SD大鼠乳鼠6只，酒精浸泡缺氧处死，超净工作台中无菌操作取颅骨，仔细剔除表面附着软组织，PBS冲洗3次至骨片透明发白，无菌培养皿中加入0．25%胰蛋白酶(含0．01%EDTA)2mL，将颅骨骨片于胰酶中剪碎，大小约1mm×1mm×1mL，全部移入离心管，37℃水浴震荡消化15min，加相同体积含胎牛血清的培养基终止消化。1000r/min离心10min，弃上清。向沉淀中加入0．1%I型胶原酶3mL，37℃水浴消化60min(每20min震荡1次)，200目滤网滤过，滤过液1000r/min离心10min，弃上清，PBS清洗沉淀，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀中加入10%含胎牛血清的DMEM培养基4mL，吹打混匀，接种于25mL培养瓶，37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱培养。滤网滤过的骨碎片经过0．1%I型胶原酶重复消化3～4次，每次消化所得细胞如上步骤接种于培养瓶。30min后将培养液吸出换瓶培养。第一次48h后换液，之后每2～3d换液1次。7～10d可融合传代。

2．3 成骨细胞的传代及纯化 酶消化法取得的成骨细胞中最易混杂成纤维细胞及少量血细胞。血细胞属于悬浮细胞，成纤维细胞比成骨细胞容易贴壁，贴壁后也更容易消化下来，故利用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。消化传代时，吸弃原培养液，PBS清洗3次，加入0．25%胰蛋白酶(含0．01%EDTA)1mL，显微镜下观察，消化至少量细胞脱落，其他细胞轮廓变圆时，吸弃消化液连同先消化掉的混杂细胞。继续加入0．25%胰蛋白酶(含0．01%EDTA)1mL，轻轻震荡培养瓶，大部分细胞脱壁时，含胎牛血清的培养基终止消化，离心收集细胞，传代。传至新培养瓶中，培养30 min后少量细胞贴壁，将培养液吸出换瓶培养，以尽量去掉先贴壁的混杂细胞。如此传代3次，成骨细胞会得到较好纯化。

2．4 常用的成骨细胞鉴定及原理 倒置相差显微镜下观察:成骨细胞接种24h后大部分均贴壁生长，呈三角形、梭形、多角形等不规则形，形态多样、排列紧密。48h后细胞形态膨大，伸展出长短不一的突起，胞核清晰可见。4～8d时，细胞分离相多见，细胞突起相互连接，汇合时细胞呈铺路石状，并可见重叠生长。见图1。

茜素红染色(钙结节染色):体外矿化是成骨细胞具有的主要特征，矿化结节(钙结节)是成骨细胞骨形成功能的形态表现，通常用茜素红法、Von Kossa’s法及四环素荧光标记法染色显示成骨细胞矿化结节［6］。茜素红染色:将纯化后的2代细胞接种到六孔板中，每孔接种2mL，以后每2d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，95%乙醇固定30min，蒸馏水冲洗3 次，0．1%茜素红 (pH8．3)染色，37℃孵育30min，蒸馏水冲洗。低倍镜视野(×40)下观察:细胞融合，局部呈多层重叠生长，堆集成灶状，形成的钙结节经茜素红染色呈橘红色。通过钙结节计数，可反映成骨细胞的矿化功能。见图2。

成骨细胞体外生长大致经过快速增殖、细胞外基质形成、基质矿化和凋亡4个阶段。有研究显示:成骨细胞生长曲线1～3 d为延滞期，4～8 d进入对数生长期，第8d以后进入平台期［7］。本研究证实体外培养大鼠颅骨成骨细胞约4日时完全贴壁，7～8d进入快速增殖期，细胞生长至单层融合状态，分裂速度开始减慢，可以传代。如继续培养(＞20d)，细胞呈多层重叠生长，骨基质成分如I型胶原等分泌活跃，最终基质矿化形成钙化结节。如继续生长，细胞逐渐失去极性，形态不易辨认。连续培养五代，可见细胞胞体增大，质稀薄，核缩小，分裂相少见等退行性改变。

3 讨 论 3．1 成骨细胞来源 据文献报道，成骨细胞来源有:①骨来源:胚胎动物或新生动物(小鼠、大鼠、兔、鸡)的颅骨、人胚胎颅骨及松质骨最常用来培养成骨细胞［8］。②骨膜来源:骨膜是膜性成骨细胞的来源，直接从骨膜中分离，或者将骨膜细胞接种于羟基磷灰石支架上进行培养，均可得到成骨细胞［9］。③骨髓间充质干细胞:骨髓间充质干细胞具有强的增殖能力和多分化潜能，在适当的条件下有向成骨细胞分化的潜能［9］。国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。本实验用48h内新生SD大鼠乳鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞形态特征、生物学活性及钙化功能。

3．2 胰蛋白酶消化时间 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或细胞对胰酶作用的反应不一样，故消化时间及程度难以掌握。胰酶分散细胞的活性主要与其浓度、温度和作用时间有关，在37℃、pH为8．0时，胰酶的作用能力最强。本实验证实，选用0．25%胰蛋白酶(含0．01%EDTA)，颅骨骨片在胰酶中剪碎时室温下作用5min，然后于37℃水浴锅中震荡消化15min。共作用20min后用一倍体积的含胎牛血清培养基终止消化，可以很好地将纤维组织、成纤维细胞、血细胞等消化下来。

3．3 I型胶原酶 胶原酶被广泛用于各种细胞的分离培养，因为在生理酸碱度和温度条件下，胶原酶能特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，但一般不会损伤其他蛋白质和组织。对于消化时间的控制，有研究证实骨组织中各种细胞耐受消化酶能力依次为:成纤维细胞＜破骨细胞＜骨祖细胞＜成骨细胞［10］。Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶均适用于成骨细胞的原代消化，但在消化1h×2次条件下用Ⅰ型胶原酶比II型胶原酶容易获得更多的成骨细胞［11］。在成骨细胞培养中，Ⅰ型胶原酶的消化作用强于Ⅱ型胶原酶，其原因可能与成骨细胞多分泌富含Ⅰ型胶原的基质有关［11］。本实验选用0．1%I型胶原酶37℃水浴消化60min，重复3～4次获得的成骨细胞纯度高，活性强。

3．4 培养基及血清浓度的选择 基础培养基加胎牛血清构成完全培养基。文献中成骨细胞的体外培养最常用的基础培养基有DMEM/F12培养基、DMEM高糖培养基和DMEM低糖培养基三种，加入胎牛血清的百分数也有10%、15%、20%等不同。资料显示，DMEM可用于许多哺乳动物细胞培养，是一种应用十分广泛的培养基。F12适用于培养血清含量较低条件下哺乳动物细胞，是开发无血清配方的基础;高糖适用于培养高密度悬浮细胞;低糖适合培养依赖性贴壁细胞，特别适于培养附着性较差、生长速度快的细胞。血清的主要作用是保护培养中的细胞，它能提供基本的营养物质、提供结合蛋白、提供激素以及各种生长因子、提供促接触和促伸展因子从而使细胞贴壁免受机械损伤。本实验发现血清浓度在10%以上对成骨细胞的生长无明显影响，可能与骨细胞特殊的生理结构及生长环境有关。实验先采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，消化后细胞成活率低;后改用DMEM/F12培养基，出现换液后培养基浑浊。最后改用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基(加hepes和双抗)，培养成骨细胞生长状况良好，换液传代均正常。

4 小 结 实验参照有关文献资料，对成骨细胞的体外分离及培养方法进行反复探究、调整和改良。胰蛋白酶和I型胶原酶联合的酶消化法获取的大鼠成骨细胞，经鉴定具有体内成骨细胞同样的生物学特性，能很好地反映成骨细胞的功能活动特点，为深入研究骨的发生和生长机制、充分认识其与外环境间的相互作用提供了理论依据及进一步实验的基础。本方法思路清晰、可操作性强、简单实用，培养的成骨细胞数量多、纯度高、易存活，是一种较好的成骨细胞的体外分离培养方法。

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