龚丽莎 综述 胡厚源 审校

(重庆市第三军医大学西南医院心血管内科，重庆400038)

在球囊扩张、支架治疗过程中，由于机械作用、缺血再灌注和血流切应力的改变，内膜不可避免地遭到损伤，血小板黏附、聚集、活化。活化的血小板促进粒细胞在损伤血管壁黏附，并激活粒细胞，直接造成内皮细胞炎症性损害[1]。粒细胞激活反过来进一步促进血小板活化和纤维蛋白沉积，促进血栓形成。血小板活化与粒细胞激活可通过释放生长因子、炎症介质和组织因子等，共同促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的迁移和增殖，导致血管再狭窄发生。

1 “血小板-粒细胞”聚集体的形成机制

黏附分子家族如选择素、整合素以及免疫球蛋白，主要介导了粒细胞、血小板和血管壁内皮细胞之间的相互作用。“血小板-粒细胞”聚集体形成主要依赖血小板激活。生理情况下，内皮细胞可通过释放一氧化氮、前列环素以及环氧合酶2等血小板抑制因子，阻止血小板在血管壁的黏附，从而发挥其抗血栓形成的作用。血管壁损伤后，细胞外基质蛋白暴露，血小板通过其表面糖蛋白Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ(glycoproteinⅠb-Ⅸ-Ⅴ，GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ)和血小板通过其表面糖蛋白Ⅵ可分别与细胞外基质蛋白血管性血友病因子和胶原相互作用，介导血小板黏附并激活。血小板激活后，其表面有丰富的P-选择素表达，以及糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa的构象发生改变而活化。激活后的血小板可通过P-选择素与粒细胞表面的P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)结合，形成“血小板-粒细胞”聚集体，促进粒细胞在血管内皮表面的浸润。P-选择素与PSGL-1相互作用，导致粒细胞激活，上调粒细胞表面β2整合素(Mac-1)的表达。粒细胞表面Mac-1可与血小板GPⅠb和连接黏附分子-C(junctional adhesion molecule C，JAM-C)结合，参与“血小板-粒细胞”聚集体形成。Mac-1还可通过纤维蛋白连接血小板GPⅡb/Ⅲa，凝血酶致敏蛋白连接粒细胞和血小板表面CD36抗原，参与“血小板-粒细胞”聚集体形成。血小板表面CD40配体(CD40 ligand，CD40L)和髓细胞表达的触发受体(receptor expressed on myeloid cell 1，TREM-1)的配体可分别与单核细胞CD40和 TREM-1结合，上调整合素表达[2]。

2 “血小板-粒细胞”聚集体与血管再狭窄

2.1 黏附分子

2.1.1 P-选择素/PSGL-1

选择素家族包括内皮细胞表面E-选择素，粒细胞表面L-选择素，以及血小板和内皮细胞表面P-选择素。P-选择素主要存在于静止血小板α颗粒和内皮细胞的Weibel小体中。血小板和内皮细胞激活后，P-选择素迅速转移至细胞表面，可与唾液酸化路易斯X(sialyl LewisX)或PSGL-1结合。P-选择素介导粒细胞在血管内皮起始滚动与黏附。激活血小板表面的P-选择素与粒细胞表面PSGL-1相互作用的结合，介导了粒细胞在血管内皮起始滚动与黏附，并可激活粒细胞，包括上调β2整合素、组织因子和炎症因子的释放。核因子κB的激活可调控血小板诱导的单核细胞炎症因子的释放。P-选择素和活化T细胞表达与分泌调节因子 (regulated upon activated normal T cell expressed and secreted，RANTES)能诱导核因子κB的核易位，导致白介素(IL)-8、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、肿瘤坏死因子-α等炎症因子的释放。“血小板-粒细胞”聚集体，较未结合血小板的粒细胞与内皮细胞表面黏附具有更高的亲和力，从而增强内皮细胞的激活。Dixon等[3]研究表明，血小板可上调单核细胞环氧合酶2而促进地诺前列酮的合成，从而发挥促炎症作用。抗P-选择素单抗或重组P-选择素糖蛋白配体(recombinant P-selectin glycoprotein ligand-Ig，rPSGL-Ig)可抑制“血小板-粒细胞”聚集体的形成;rPSGL-1可抑制流动激活的血小板在损伤血管表面的黏附。rPSGL-Ig可通过减轻损伤血管壁的炎症反应，而抑制猪冠状动脉球囊损伤后新生内膜的形成和血栓性反应[4]。

2.1.2 Mac-1/GPⅠb

Mac-1是粒细胞表面主要的β2整合素。Mac-1可与纤维蛋白原、血小板表面的GPⅠb以及内皮细胞表面的细胞间黏附分子结合。整合素与粒细胞表面配体的相互作用可导致粒细胞肌动蛋白细胞骨架重排、中性粒细胞迁移、脱颗粒和呼吸爆发[5]。Src家族激酶(酪氨酸激酶)的活化，参与上述整合素介导的细胞信号事件。Src家族激酶可导致富含脯氨酸的酪氨酸激酶-2和Nef相关因子-1(Nef-associated factor 1，Naf-1)的磷酸化，从而介导整合素在血管内皮的稳定黏附。磷酸化的Naf-1通过募集磷脂酰肌醇3-OH，从而活化Mac-1[6]。临床研究显示，中性粒细胞的激活(检测粒细胞表面Mac-1表达)与晚期管腔丢失和血管再狭窄相关[7]。体外研究表明，Mac-1拮抗剂可抑制粒细胞表面Mac-1与GPⅠbα的静态黏附;在层流状态下，Mac-1拮抗剂可抑制粒细胞与血小板的黏附;在小鼠股动脉导丝损伤模型中，Mac-1拮抗剂可减少粒细胞在损伤血管壁的积累，并可抑制细胞增殖和新生内膜增生[8]。

2.1.3 CD40L/CD40

CD40L与其受体CD40，分别属于肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子受体家族，在调节免疫和炎症反应方面起重要作用。CD40L主要来源于激活的血小板，CD40L在数分钟至数小时内发生蛋白水解，形成可溶性CD40L(sCD40L)。sCD40L可促进炎症反应和血栓形成[9]。CD40L与CD40相互作用可诱导内皮细胞或单核细胞合成黏附分子、趋化因子和组织因子;血小板CD40L以自分泌方式与整合素αⅡbβ3结合，具有稳定血栓的作用[10]。在 CD40L－/－或 CD40－/－小鼠模型中，“血小板-粒细胞”聚集体数量减少，提示血小板表面CD40L与粒细胞表面CD40的结合介导了“血小板-粒细胞”聚集体的形成。有文献表明，重组sCD40L可刺激血小板P-选择素和粒细胞Mac-1的表达，以及“血小板-粒细胞”聚集体的形成;抗CD40L抗体和抗Mac-1抗体可分别抑制这一相互作用。抗CD40L抗体可抑制apoE－/－小鼠颈动脉损伤血管新生内膜的形成[11]。临床研究表明，经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)患者的sCD40L水平升高，提示炎症反应的增强和再狭窄的发生，并在术后6个月随访时，出现支架管腔的丢失[12]。

2.2 细胞因子

2.2.1 MCP-1

MCP-1及其趋化因子受体2(C-C chemokine receptor type 2，CCR2)可介导单核细胞募集，促进动脉粥样硬化病变的发展。MCP-1/CCR2在血管损伤的血管新生内膜形成作用已被广泛的研究。支架置入术后，发生血管再狭窄患者的血浆MCP-1水平升高，以及损伤血管壁的巨噬细胞浸润，提示MCP-1可能介导了管腔的再狭窄[13]。血小板激活释放的血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)可诱导血管平滑肌细胞MCP-1的表达。在动物血管损伤模型研究中，血管平滑肌细胞MCP-1 mRNA表达在24 h内迅速上调[14]。抗MCP-1抗体不仅可有效抑制单核巨噬细胞在损伤血管壁的浸润，还可以显著减轻经皮血管成形术后新生内膜的增生[15]。CCR2基因敲除小鼠血管新生内膜病变的VSMCs含量显著减少[16]。

2.2.2 IL-1

IL-1是主要由激活巨噬细胞分泌的促炎症细胞因子。IL-1可作为许多细胞的生长因子，包括成纤维细胞、淋巴细胞及VSMCs。IL-1还可诱导促炎症细胞因子IL-6和IL-8的合成。IL-1诱导的内皮细胞表面各种粒细胞黏附分子基因表达，如 E-选择素。Libby等[17]提出再狭窄级联反应模型，即巨噬细胞分泌IL-1，可触发VSMCs和内皮细胞以自分泌和旁分泌反馈回路方式再次释放细胞因子和生长因子，从而放大和维持细胞增殖反应，最终导致新生内膜增生。重组人IL-1受体拮抗剂能抑制VSMCs增殖，提示IL-1受体拮抗剂可干扰其自分泌调节过程，从而抑制新生内膜增生和再狭窄发生。

2.2.3 RANTES

RANTES是由血小板激活产生的趋化因子。流动状态下，RANTES在激活内皮细胞表面沉积介导单核细胞的浸润[18]。而RANTES由血小板转移至内皮细胞表面的沉积，依赖于血小板表面的P-选择素。在apoE－/－小鼠颈动脉损伤模型中，RANTES受体拮抗剂可显著减少体内新生内膜病变面积和泡沫细胞浸润。在血管损伤4周后，其内皮细胞表面可发现RANTES的沉积，然而在P-选择素缺陷小鼠中未发现RANTES的沉积[19]。RANTES与血小板P-选择素共同参与单核细胞趋化因子的合成[20]。

2.3 组织因子

组织因子，即凝血因子Ⅲ，本质是一种相对分子量4.7×104的单链跨膜蛋白。组织因子与凝血因子Ⅶ(FⅦ)结合，使其激活为FⅦa。组织因子-FⅦa复合物迅速激活FⅩ，启动外源性凝血途径。FⅩa使凝血酶原转换为凝血酶，导致纤维蛋白形成、血小板激活，最终形成血栓。组织因子可促进单核细胞在血管内皮细胞表面黏附和内皮下迁移。经皮血管成形术后患者血浆组织因子水平在4 h和24 h明显增加，同时伴血浆凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物水平增加[21]。组织因子/Ⅶa因子复合物可促进VSMCs迁移和增殖，导致PTCA术后新生内膜形成[22]。组织因子的胞浆结构主要参与VSMCs的迁移，从而促进血管壁重构。

2.4 血小板来源的生长因子

2.4.1 PDGF

经皮冠状动脉介入治疗导致血管壁损伤，内皮细胞的激活促进血栓形成。血栓可诱导多种细胞因子和生长因子释放。PDGF是血管壁新生内膜增生强有力的促进因子。PDGF不仅能刺激VSMCs增殖，且通过启动多条信号通路促进VSMCs迁移。PTCA后再狭窄病变部位的PDGF受体表达上调。PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂可抑制PTCA术后血管再狭窄[23]。激活的血小板产生的凝血酶又可促进PDGF释放，进一步导致VSMCs的增殖和再狭窄发生[24]。

2.4.2 转化生长因子-β

转化生长因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)能刺激细胞外基质和VSMCs内脱氧核糖核酸的合成。在原发动脉粥样硬化病变基础上，发生再狭窄病变区域TFG-β mRNA表达增加。TGF-β不仅能通过上调VSMCs整合素αV和β3表达，促进平滑肌细胞迁移，还可趋化单核细胞和中性粒细胞[25]。TGF-β还能调节Mac-1和尿激酶受体的表达。Mac-1和尿激酶受体可分别与纤维蛋白和玻璃黏连蛋白结合，促进VSMCs和单核细胞在支架内浸润[26]。

3 “血小板-粒细胞”聚集体是血管再狭窄治疗的新靶向

“血小板-粒细胞”聚集体数量增加是反映多种疾病炎症状态的重要指标。采用流式细胞仪测定“血小板-粒细胞”聚集体，可以提供有关患者体内血小板激活、抗血小板药物治疗反应，心血管疾病诊断等资料。血小板的激活在急性冠状动脉综合征的发生中起着重要作用。P-选择素被认为是血小板激活特异性指标。经皮冠状动脉介入治疗的术后患者、发生急性心肌梗死的急性胸痛患者体内“血小板-单核细胞”聚集体明显增加，而P-选择素阳性血小板百分率无明显变化，提示“血小板-单核细胞”聚集体是更为敏感血小板的激活标志。目前临床广泛应用的抗血小板药物二磷酸腺苷(ADP)受体(P2Y12)拮抗剂，就具有抑制“血小板-粒细胞”聚集体形成的作用。氯吡格雷在降低血小板表面P-选择素表达的同时，可显著减少动脉粥样硬化疾病患者血液中“血小板-粒细胞”聚集体的形成。有研究显示，在小鼠内毒素休克模型中，新一代的ADP受体(P2Y12)拮抗剂普拉格雷可抑制血小板与粒细胞的相互作用，并减低炎性标志物的产生。早期May等[27]研究表明，冠状动脉支架置入术后，采用联合抗血小板治疗(阿司匹林、噻氯匹啶)患者治疗4 d后，“血小板-单核细胞”聚集体明显减少，单核细胞Mac-1的表达显著降低，L-选择素水平增加;然而，经标准抗凝治疗12 d后，上述指标并无明显改变，提示抗血小板治疗可抑制单核细胞与血小板相互作用，从而抑制单核细胞激活，因此降低血栓事件风险。应用阿昔单抗(GPⅡb/Ⅲa拮抗剂)治疗脑血管疾病患者颈动脉支架置入术后患者，“血小板-单核细胞”聚集体数量显著减少，单核细胞组织因子的表达降低，从而限制血栓发展。阿昔单抗还可通过降低血浆sCD40L水平，促进血栓稳定[28]。因此，特异性针对血小板-粒细胞相互作用环节的干预方向，将有望为动脉粥样硬化病变和血管再狭窄防治提供新的措施。

[1]Smyth SS，McEver RP，Weyrich AS，et al.Platelet functions beyond hemostasis[J].J Thromb Haemost，2009，7(11):1759-1766.

[2]van Gils JM，Zwaginga JJ，Hordijk PL.Molecular and functional interactions among monocytes，platelets，and endothelial cells and their relevance for cardiovascular diseases[J].J Leukoc Biol，2009，85(2):195-204.

[3]Dixon DA，Tolley ND，Bemis-Standoli K，et al.Expression of COX-2 in platelet-monocyte interactions occurs via combinatorial regulation involving adhesion and cytokine signaling[J].J Clin Invest，2006，116(10):2727-2738.

[4]Wang K，Zhou Z，Zhou X，et al.Prevention of intimal hyperplasia with recombinant soluble P-selectin glycoprotein ligand-immunoglobulin in the porcine coronary artery balloon injury model[J].J Am Coll Cardiol，2001，38(2):577-582.

[5]Lowell CA，Berton G.Integrin signal transduction in myeloid leukocytes[J].J Leukoc Biol，1999，65(3):313-320.

[6]Evangelista V，Pamuklar Z，Piccoli A，et al.Src family kinases mediate neutrophil adhesion to adherent platelets[J].Blood，2007，109(6):2461-2469.

[7]Inoue T，Kato T，Hikichi Y，et al.Stent-induced neutrophil activation is associated with an oxidative burst in the inflammatory process，leading to neointimal thickening[J].Thromb Haemost，2006，95(1):43-48.

[8]Wang Y，Sakuma M，Chen Z，et al.Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury[J].Circulation，2005，112(19):2993-3000.

[9]Lievens D，Zernecke A，Seijkens T，et al.Platelet CD40L mediates thrombotic and inflammatory processes in atherosclerosis[J].Blood，2010，116(20):4317-4327.

[10]Andre P，Prasad KS，Denis CV，et al.CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism[J].Nat Med，2002，8(3):247-252.

[11]Li G，Sanders JM，Bevard MH，et al.CD40 ligand promotes Mac-1 expression，leukocyte recruitment，and neointima formation after vascular injury[J].Am J Pathol，2008，172(4):1141-1152.

[12]Cipollone F，Ferri C，Desideri G，et al.Preprocedural level of soluble CD40L is predictive of enhanced inflammatory response and restenosis after coronary angioplasty[J].Circulation，2003，108(22):2776-2782.

[13]Cipollone F，Marini M，Fazia M，et al.Elevated circulating levels of monocyte chemoattractant protein-1 in patients with restenosis after coronary angioplasty[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21(3):327-334.

[14]Schober A，Weber C.Mechanisms of monocyte recruitment in vascular repair after injury[J].Antioxid Redox Signal，2005，7(9-10):1249-1257.

[15]Furukawa Y，Matsumori A，Ohashi N，et al.Anti-monocyte chemoattractant protein-1/monocyte chemotactic and activating factor antibody inhibits neointimal hyperplasia in injured rat carotid arteries[J].Circ Res，1999，84(3):306-314.

[16]Egashira K，Zhao Q，Kataoka C，et al.Importance of monocyte chemoattractant protein-1 pathway in neointimal hyperplasia after periarterial injury in mice and monkeys[J].Circ Res，2002，90(11):1167-1172.

[17]Libby P，Schwartz D，Brogi E，et al.A cascade model for restenosis.A special case of atherosclerosis progression[J].Circulation，1992，86(6 suppl):Ⅲ47-Ⅲ52.

[18]von Hundelshausen P，Weber KS，Huo Y，et al.RANTES deposition by platelets triggers monocyte arrest on inflamed and atherosclerotic endothelium[J].Circulation，2001，103(13):1772-1777.

[19]Schober A，Manka D，von Hundelshausen P，et al.Deposition of platelet RANTES triggering monocyte recruitment requires P-selectin and is involved in neointima formation after arterial injury[J].Circulation，2002，106(12):1523-1529.

[20]Weyrich AS，Elstad MR，McEver RP，et al.Activated platelets signal chemokine synthesis by human monocytes[J].J Clin Invest，1996，97(6):1525-1534.

[21]Mizuno O，Hojo Y，Ikeda U，et al.Assessment of coagulation and platelet activation in coronary sinus blood induced by transcatheter coronary intervention for narrowing of the left anterior descending coronary artery[J].Am J Cardiol，2000，85(2):154-160.

[22]Cirillo P，Cali G，Golino P，et al.Tissue factor binding of activated factorⅦtriggers smooth muscle cell proliferation via extracellular signal-regulated kinase activation[J].Circulation，2004，109(23):2911-2916.

[23]Jandt E，Mutschke O，Mahboobi S，et al.Stent-based release of a selective PDGF-receptor blocker from the bis-indolylmethanon class inhibits restenosis in the rabbit animal model[J].Vascul Pharmacol，2010，52(1-2):55-62.

[24]Sironi M，Sciacca FL，Matteucci C，et al.Regulation of endothelial and mesothelial cell function by interleukin-13:selective induction of vascular cell adhesion molecule-1 and amplification of interleukin-6 production[J].Blood，1994，84(6):1913-1921.

[25]Wahl SM，Allen JB，Weeks BS，et al.Transforming growth factor beta enhances integrin expression and type IV collagenase secretion in human monocytes[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1993，90(10):4577-4581.

[26]Tan SM.The leucocyte beta2(CD18)integrins:the structure，functional regulation and signalling properties[J].Biosci Rep，2012，32(3):241-269.

[27]May AE，Neumann FJ，Gawaz M，et al.Reduction of monocyte-platelet interaction and monocyte activation in patients receiving antiplatelet therapy after coronary stent implantation[J].Eur Heart J，1997，18(12):1913-1920.

[28]Kopp CW，Steiner S，Nasel C，et al.Abciximab reduces monocyte tissue factor in carotid angioplasty and stenting[J].Stroke，2003，34(11):2560-2567.