龙 柯，李 响，谢通慧，张永奎，刘文彬

科研与开发

以油莎豆为原料发酵生产威兰胶的研究*

龙 柯，李 响，谢通慧，张永奎，刘文彬

（四川大学化学工程学院制药与生物工程系，四川成都610065）

为降低威兰胶生产成本，提高其产量，以油莎豆为原料，通过提取油脂、蛋白质和水解等处理，制得豆饼粕水解液作为底物，发酵生产威兰胶。结果表明：在不添加其他氮源或营养盐条件下，以水解液为底物生产威兰胶，产量为24.12g·L-1，较葡萄糖发酵组提高26.68%，威兰胶产品的剪切性能值为4.40。使用油莎豆粕水解液发酵生产威兰胶，发酵培养基中不需添加额外碳氮源，产量和剪切性能均优于利用葡萄糖发酵的结果。由此可见，油莎豆是生产威兰胶的一种优质原料。

廉价底物；油莎豆水解液；威兰胶；发酵

威兰胶（Welan Gum）是由鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.ATCC 31555经好氧发酵生成的一种胞外多糖[1]。威兰胶具有热稳定性、增粘性、触变性以及假塑性等理化性质，在石油开采及混凝土等诸多方面得到广泛应用，是比黄原胶和结冷胶更具市场前景的微生物代谢多糖[2，3]。研究表明，蔗糖或葡萄糖是发酵生产威兰胶的较优碳源，酵母膏或蛋白胨为较优氮源[4-6]。然而，这些生化原料价格不菲，使得威兰胶生产成本较高，极大地限制了其大规模生产和应用。因此，寻找一种廉价底物代替传统碳氮源生产威兰胶就显得极为必要和迫切。国内外关于利用廉价原料发酵生产威兰胶的报道较少，仅见姬彬[7]利用甘蔗糖蜜、粗甘油、果葡糖浆及木薯淀粉等廉价碳源进行发酵威兰胶研究。结果表明：前3种碳源发酵威兰胶产量不够理想，以木薯淀粉水解液为底物时威兰胶产量为21.2g·L-1，与以葡萄糖为碳源时的产胶量相当，威兰胶产量并未得到较大提高，且发酵培养基中需额外添加豆粕作为氮源，这也增加了生产成本。

油莎豆（Cyperus esculentus）是一种莎草科草本植物，其具有含油量较高，抗逆性极强，对土壤要求不严格，易于栽培管理等特点，且不与大豆、花生、油菜等草本油料作物及水稻、玉米等主粮食作物争地，可规模推广种植，是理想的生物质能源原料[8-10]。目前，油莎豆主要用于制备生物柴油，提取油脂后所得豆粕废弃不用，其富含的淀粉、糖分和蛋白质的价值没有得以利用，同时还造成了环境污染。目前，国内外开展了以油莎豆饼粕为原料生产燃料酒精[11]、微藻生物油脂[12]等的研究，都取得了一定进展。本研究以油莎豆饼粕为威兰胶的生产原料，既可降低威兰胶生产成本，又可实现油莎豆饼粕的综合利用，解决环境问题。

以油莎豆粕水解液（C.esculentus waste hydrolysate，CEWH）作为底物，不再添加其他氮源发酵生产威兰胶，进一步降低生产成本，并获得较高产量是本研究的主要任务。本论文对油莎豆成分进行了分析，研究了不同碳源和营养盐对发酵结果的影响，对发酵过程中菌体、产物、残糖浓度进行了检测，并对生产的威兰胶进行了剪切性能检测。

1 材料与方法

1.1 材料

鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.ATCC31555购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，即ATCC）；油莎豆产自新疆克拉玛依市，样品晒干后粉碎，粒度控制在85%，通过80目，混匀，烘干待用。

1.2 培养基

Sphingomonas培养基（g·L-1）:葡萄糖15；酵母膏2；蛋白胨5；牛肉浸膏3；pH值为7.0，1×105Pa灭菌20min。

油莎豆水解液发酵培养基（g·L-1）:制备的油莎豆粕水解液，pH值为7.0，1×105Pa灭菌20min。

葡萄糖发酵培养基（g·L-1）:葡萄糖50；蛋白胨3；K2HPO42；MgSO4·7H2O0.5；CaCO32；pH值为7.0，1×105Pa灭菌20 min。

1.3 方法

水解液的制备：将粉碎研磨好的油莎豆粉末用正己烷溶液浸出提取油脂后，在碱性条件下提取蛋白质，最后利用200μ·g-1α-淀粉酶和100μ·g-1糖化酶水解油莎豆饼粕，制得水解液。提取油脂时的料液比、混合时间，以及提取蛋白质时的浸泡时间按照实验设计而定。

细胞培养与发酵培养：将4℃保存的斜面种子于平板划线培养，挑取单菌落于种子培养基上，摇床180r·min-1、30℃培养28h；再以10%接种量接种于种子培养基上，同等条件培养24h，接种到发酵培养基上，摇床180r·min-1、30℃发酵培养72h。

威兰胶产量测定：0.05g KCl添加到20mL发酵液中，待其完全溶解后，与95%乙醇按1∶3体积比混合，搅拌得胶体沉淀，洗涤，离心，收集威兰胶沉淀，50℃烘干至恒重，粉碎，称重得威兰胶样品。

胶复溶液制备：将1.0g威兰胶产品溶解到350 mL浓度为42g·L-1的NaCl溶液中。

油脂提取：采用溶剂浸出法，按料液比8∶1加入正己烷，在涡旋混合仪上振荡混合2min，1700 r· min-1离心5 min，取上清液真空旋蒸得到油脂。

蛋白质提取：采用碱提酸沉法[13]，按料液比1∶10，使用2mol·L-1NaOH溶液将pH值调至10的碱性条件下，浸泡1.5h离心提取上清液，调节pH值至等电点4.8，提取蛋白质。

根据GB/T5009.3，采用直接干燥法对含水率进行测定[14]。根据GB/T5009.5，采用凯氏定氮法测定蛋白质含量[14]。根据GB/T5009.6，采用索氏提取法测定油脂含量[14]。采用旋光法对淀粉含量进行测定[15]。采用灼烧法对灰分含量进行测定[16]。总糖和残糖浓度的测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法。含鞘氨醇单胞菌溶液稀释10倍后利用紫外分光光度计在600nm处测定生物量。用NDJ-1型旋转粘度计（上海恒平科学仪器有限公司，4号转子，分别在6和60r·min-1），于室温条件下测定黏度。

1.4 计算公式

2 结果与讨论

2.1 油莎豆成分、预处理及水解

2.1.1 油莎豆成分油莎豆含有丰富的油脂、淀粉、糖类、蛋白质等营养成分。根据上述方法对实验所用油莎豆进行分析，其主要成分结果见表1。

表1 油莎豆主要成分分析Tab.1 The principal constituents of the Cyperus esculentus

分析结果与文献报道结果基本吻合，淀粉含量为31.1%，表明所用油莎豆适宜作为生产威兰胶的原料，其淀粉成分经水解后产生的葡萄糖可作为发酵生产威兰胶的碳源，蛋白质可作为发酵的氮源。

2.1.2 原料的预处理前期以可溶性淀粉作为唯一碳源进行摇瓶发酵实验，未检测到威兰胶的生成，表明鞘氨醇单胞菌不能分泌胞外淀粉酶，不能直接利用可溶性淀粉作为碳源进行发酵。因此，油莎豆饼粕需要经过进一步水解才能被利用。

油莎豆预处理过程见图1。

图1 油莎豆粕水解液制备流程Fig.1 Preparation flow diagram of CEWH

采用溶剂浸出法，油脂提取率可达到88%。提取油脂后的油莎豆饼粕中残余油脂量约为3%。有研究结果表明，大豆油等油脂可作为氧载体，改善发酵系统供氧情况，提高胞外多糖产率[17]。因此，少量的残油不仅不会对威兰胶发酵产生不利影响，反而可以促进发酵过程。

为保证豆粕中总糖与蛋白质的质量分数比（即C/N）在适合微生物胞外多糖合成的范围，需提取豆粕中部分蛋白质。蛋白质提取率达到37.79%，豆粕中总糖与蛋白质的质量分数比（即C/N）为13.1。

2.1.3 水解结果利用双酶法（α-淀粉酶、糖化酶）水解油莎豆饼粕结果见表2。

表2 油莎豆水解结果Tab.2 Results of Cyperus esculentus hydrolysis

通过水解得到10.96g还原糖和1.42g蛋白质供后续发酵中分别作为碳源和氮源使用。

2.2 发酵过程优化

2.2.1 不同碳源对发酵的影响实验分别以水解液、葡萄糖以及水解液葡萄糖混合物为碳源进行发酵，研究不同碳源对威兰胶产量的影响，碳源浓度梯度设计见图2。

图2 不同碳源对威兰胶产量的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on welan gum yield

图2 表明，以纯水解液为碳源时，威兰胶产量最高。以纯葡萄糖为碳源的威兰胶产量最低。在混合碳源体系中，随着水解液混合浓度逐渐降低，威兰胶产量也不断降低。具体地对比分别以纯水解液和纯葡萄糖为碳源发酵威兰胶的结果，见表3。

表3 威兰胶发酵结果对比Tab.3 Comparison between the experimental and the control group in welan fermentation

由表3可以看出，水解液组的产物浓度高于葡萄糖组，达到了24.12g·L-1，与刘汝冰[6]、李莎[4]等人优化发酵培养基后的结果（产量分别为21.77和22. 85g·L-1）相当。另外，还原糖利用率也明显高于传统的葡萄糖培养基。各项对比数据中，只有发酵结束时细胞浓度略低于葡萄糖组。

油莎豆粕水解液是一个较为复杂的溶液系统，除了油脂、糖类和蛋白质等主要成分外，还含有Al、Ca、Fe、K、Mg、Na及P等矿物质[18]。葡萄糖在威兰胶合成过程中具有两条代谢通路：（1）转化为构成威兰胶的前体核苷酸糖；（2）通过中心代谢途径合成菌体细胞的基本结构[19]。这些矿物盐的金属离子可以激活葡萄糖磷酸变位酶、UDP葡萄糖焦磷酸化酶、dTDP葡萄糖焦磷酸化酶等威兰胶合成关键酶[20]，使得更多葡萄糖通过第一条代谢通路合成前体核苷酸糖，相应地减少第二条代谢通路的通量，使得威兰胶产量增加，鞘氨醇单胞菌细胞量相应降低。因此，水解液组中细胞浓度较低，而还原糖利用率和产物浓度较高。这说明以水解液为底物，单个鞘氨醇单胞菌细胞能分泌更多威兰胶产品。综上所述，纯水解液是比混合碳源体系或纯葡萄糖更优的威兰胶发酵底物。

2.2.2 营养盐对发酵的影响磷是菌体核酸、辅酶和高能磷酸键组成成分，其在能量转变过程中起关键作用。镁被称为生命活动的激活剂，是细胞中许多酶的激活剂。在水解液发酵系统中也考察了K2HPO4·3H2O在0～5g·L-1的浓度范围内和MgSO4· 7H2O在0～1g·L-1浓度范围内对威兰胶发酵的影响，结果见图3。

图3 K2HPO4·3H2O浓度（a）和MgSO4·7H2O（b）浓度对威兰胶产量的影响Fig.3 Welan gum yield with the concentration of K2HPO4·3H2O（a）and MgSO4·7H2O（b）

利用origin 8.5软件对在水解液发酵系统中添加K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O对威兰胶产量影响进行显著性分析。K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O的P值分别为0.2431和0.129，说明两者均不是影响威兰胶产量的显著因素。

从图3可以看出，随着MgSO4·7H2O浓度的增加，威兰胶产量变化不大；随K2HPO4·3H2O浓度的增加，威兰胶产量反而降低。这一现象是因为在水解液这一混合系统中所含有的磷、镁等营养元素已经能够满足威兰胶发酵的需要。添加K2HPO4·3H2O后，发酵液中磷元素含量过高，反而会抑制鞘氨醇单胞菌细胞的生长，进而影响威兰胶产量。

实验证明，油莎豆粕水解液中磷、镁等营养元素可以满足鞘氨醇单胞菌细胞生产和分泌威兰胶的需要，无需额外添加K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O。

2.3 优化条件下发酵结果

2.3.1 摇瓶发酵过程曲线以制备的水解液为发酵液，摇床转速180r·min-1在30℃条件下摇瓶发酵培养72h。发酵过程曲线见图4。

图4 摇瓶发酵过程曲线Fig.4 The curve of welan fermentation in shake-flask culture

菌体生长有较短的延滞期（0～4h），之后随着底物在8～48h内快速消耗，菌体快速生长，威兰胶随菌体生长而大量合成。48h生物量达到最大，之后进入稳定期，基质浓度较低，消耗速率下降，威兰胶合成速度缓慢。54h后，由于基质的消耗和环境因素的影响，细胞逐渐进入衰亡期，部分细胞出现自溶，菌体浓度开始下降。

菌体的延滞期为0～4h，短于李会等人[21]的研究结果（0～8h）。这可能是由于本实验使用的鞘氨醇单胞菌菌种前期经过了两次活化，使得菌体更快地适应发酵培养环境，延滞期缩短，这有利于增加菌体分泌威兰胶的时间。

2.3.2 威兰胶剪切性能检测威兰胶在低剪切率时黏度很高，随着剪切率升高，其黏度随之减少。这一优越的剪切性能使威兰胶在石油（作为调配钻井泥浆和新型驱油剂）、混泥土（增强泥浆保水性）等工业中有广泛应用前景。因此，有必要对油莎豆粕水解液发酵生产的威兰胶与葡萄糖培养基发酵生产的威兰胶在剪切性能方面进行对比，结果见表4。

表4 威兰胶剪切性能对比Tab.4 Comparison between the experimental gum and the control gum in shear properties

结果表明，两组威兰胶产品的pH值都在5.0～5.5范围内，这是因为威兰胶主链重复结构上有一葡萄糖醛酸，因而产品复溶液呈酸性。两组威兰胶溶液的粘度都随剪切速率增加而降低，具有明显的剪切变稀特性。水解液发酵生产的威兰胶在较低剪切率（6r·min-1）和较高剪切率（60r·min-1）时黏度均高于葡萄糖组，总体剪切性能值较葡萄糖组更高。这可能是由于威兰胶与油莎豆水解液中的矿物质产生某种交联作用[22]，使剪切性能得以提高。说明油莎豆粕水解液发酵生产的威兰胶性能良好，具有较高的市场价值。

3 结论

对本研究所用油莎豆的成分分析表明其含油量为25.66%、淀粉含量为31.10%、蛋白质含量为5.49%，淀粉含量较文献报道含量略高，是低成本发酵生产威兰胶的优质原料。研究了以水解液、葡萄糖以及水解液葡萄糖混合物为碳源对威兰胶产量的影响，结果表明以纯水解液为碳源时威兰胶产量最高，说明其更有利于菌体产胶。向水解液中添加K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O，发现两者对威兰胶产量影响均不显著，说明水解液中磷、镁等营养盐可以满足鞘氨醇单胞菌细胞生产和分泌威兰胶的需要。在优化条件下，摇瓶培养鞘氨醇单胞菌生产威兰胶，对发酵过程进行监测，结果表明菌体、残糖、威兰胶浓度变化符合微生物胞外多糖发酵的一般规律，威兰胶产量可到达24.12g·L-1。对威兰胶产品剪切性能进行检测，表明其剪切性能优于葡萄糖发酵组。本研究证明油莎豆饼粕在无需添加其他碳源或氮源的情况下，通过水解处理可用作发酵生产威兰胶的底物，且发酵产品在产量和剪切性能方面均优于常规底物发酵产品，是一种优质的原料。本研究为以油莎豆为原料在更大规模生物反应器中实现威兰胶工业化生产奠定了基础。

［1］Corbin B D,Seeley E H,Raab A,et al.Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses［J］.Science,2008,319（5865）:962-965.

［2］Allen F L,Best G H,Lindroth T A.Welan gumin cement compositions［P］.U.S：4,963,668，1990-10-16.

［3］Hoskin D H,Mitchell T O,Shu P.Oil reservoir permeability profile controlwith crosslinked welan gumbiopolymers［P］.U.S：4,991,652，1991-02-12.

［4］李莎.威兰胶发酵工艺优化及结构性能的研究［D］.南京:南京工业大学,2005.

［5］周浩然.微生物多糖威兰胶生产工艺的研究［D］.无锡:江南大学,2009.

［6］刘汝冰.新型微生物多糖威兰胶的发酵研究［D］.南京:南京农业大学,2008.

［7］姬彬.威兰胶发酵及其流变性研究［D］.无锡:江南大学,2012.

［8］瞿萍梅,程治英,龙春林,等.生物柴油植物“油莎豆”的发展前景［J］.再可生能源,2008,26（1）.

［9］黄春荣,梁文章,孙祖东.非粮生物质能源植物“油莎豆”的产业化前景及对策［J］.大众科技,2011（5）:147-149.

［10］瞿萍梅,程治英,龙春林,等.油莎豆资源的综合开发利用［J］.中国油脂,2007,32（9）:61-63.

［11］陈石.利用油莎豆制备可再生能源的研究［D］.长沙:中南大学, 2008.

［12］Wang W,Zhou W,Liu J,et al.Biodiesel production from hydrolysate of Cyperusesculentus waste by Chlorella vulgaris［J］. Bioresource technology,2013,136:24-29.

［13］Jangchud A,Chinnan M.S.Properties of peanut protein film: sorptionisothermandplasticizer effect［J］.LWT-Food Scienceand Technology,1999,32（2）:89-94.

［14］中华人民共和国国家标准.食品卫生检验方法（理化部分）［M］.北京:中国标准出版社出版,2004.

［15］宁正祥.食品成分分析手册［M］.北京:中国轻工业出版社, 2001.39-40.

［16］陈星,陈滴,刘蕾.油莎豆全成分分析［J］.食品科技,2009，（3）：165-168.

［17］林琳,邓春,龙柯,等.氧载体在黄原胶发酵中的应用［J］.食品工业科技,2011，（8）:192-194.

［18］Ozcan MM,Gumuscu A,Er F,et al.Chemical and fattyacid composition ofCyperusesculentus［J］.Chemistryofnatural compounds, 2010,46（2）:276-277.

［19］Li H,Xu H,Li S,et al.Strain improvement and metabolic flux modeling of wild-type and mutant Alcaligenes sp.NX-3 for synthesis of exopolysaccharidewelan gum［J］.Biotechnologyand Bioprocess Engineering,2010,15（5）:777-784.

［20］Andreini C,Bertini I,Cavallaro G,et al.Metal ions in biological catalysis:from enzyme databases to general principles［J］.Journal ofBiological Inorganic Chemistry,2008,13（8）:1205-1218.

［21］李会,李莎,徐虹.Alcaligenes sp.CGMCC2428产威兰胶的分批发酵动力学模型［J］.南京工业大学学报（自然科学版），2010,（4）:007.

［22］曹祥薇.明胶/多糖类胶体复配胶的凝胶特性及应用［D］.武汉:湖北工业大学,2011.

Welan gum production from cyperus esculentus fermented by sphingomonas sp.ATCC 31555*

LONG Ke，LI Xiang，XIE Tong-hui，ZHANG Yong-kui*，LIUWen-bin
（Department of Pharmaceutical&Biological Engineering,School of Chemical Engineering,Sichuan University, Chengdu 610065,China）

To lower the production cost of welan gum and raise the production，how to utilize the C.esculentus waste hydrolysate（CEWH）,which has been extracted its oil and part of the protein,as the substrate to ferment welan gum was investigated.Under the condition of using CEWH as substrate,and adding neither nitrogen source nor nutritive salt,the production of welan gum reached the maximum of 24.12g·L-1,which was 26.68%more than that of using glucose to ferment.The values of shear properties of welan gum also come to 4.40.When using the C. esculentus waste hydrolysate to ferment the welan gum,there is no need to add other carbon source nor nitrogen source in the fermentation medium and both the production as well as the sheer properties are better than the results of using glucose to ferment.Thus,the C.esculentus is a cheap and high quality raw material to produce the welan gum.

cheap substrates；C.esculentus waste hydrolysate（CEWH）；welan gum；fermentation

1002-1124（2014）08-0001-05

2014-04-24

科技型中小企业技术创新资金项目（No.10C26215104937）;四川省科技型中小企业早期科技创新省级扶持资金无偿补助项目;国家级大学生创新创业训练计划项目（No. 201210610036）

龙柯（1987-），男，硕士研究生，主要从事微生物发酵研究。

刘文彬（1981-），男，讲师，理学博士，主要从事应用微生物方向研究。

Q93

A