熊爱琴，马萍,刘俊梅，徐烨华，王洋，徐清斌

瑞舒伐他汀对慢性心力衰竭大鼠的心脏保护作用及其对非对称二甲基精氨酸代谢通路的影响*

熊爱琴，马萍,刘俊梅，徐烨华，王洋，徐清斌

目的：探讨瑞舒伐他汀对慢性心力衰竭大鼠的心脏保护作用及其对非对称二甲基精氨酸（ADMA）代谢通路的影响。

瑞舒伐他汀；异丙肾上腺素；慢性心力衰竭；非对称二甲基精氨酸；蛋白精氨酸甲基转移酶1；二甲基精氨酸二甲胺水解酶2

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:743.)

慢性心力衰竭是由于各种原因引起的初始心肌损伤导致肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统兴奋性增高，各种神经内分泌介质又促进心肌重构，加重心肌损伤和心功能恶化，形成恶性循环[1]。他汀类药物是胆固醇合成通路中限速酶-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂, 能减少胆固醇合成, 临床主要用于降脂治疗。近年来研究发现他汀类药物还有改善心肌肥厚和纤维化,逆转心室重构的作用[2]。从分子生物角度研究认为心力衰竭本质是心肌组织细胞中蛋白表达与调控异常而引起的疾病[3]。非对称二甲基精氨酸（ADMA）是一种内源性一氧化氮合酶抑制剂，是心血管疾病的的一种危险因子[4]。临床及动物实验研究表明，心力衰竭患者体内ADMA水平显著增多，异丙肾上腺素所致大鼠急性心肌缺血时ADMA含量增多[5]。本实验旨在通过建立异丙肾上腺素致大鼠慢性心力衰竭动物模型，研究瑞舒伐他汀对异丙肾上腺素诱导的大鼠慢性心力衰竭心脏的保护作用及其对ADMA代谢通路的影响。

1 材料与方法

动物：清洁级雄性SD大鼠，体重210～250 g，2012-12由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（宁）2012-0001。

药品和试剂：瑞舒伐他汀片剂购自英国的阿斯利康公司，批号：122653；异丙肾上腺素（购自上海梯西爱有限公司，纯度＞99.0%，批号：MVSTFNF）；心肌肌钙蛋白I、脑钠肽、ADMA酶联免疫反应检测试剂（购自武汉华美试剂有限公司）；乌拉坦、氯化钠、多聚甲醛（美国Sigma公司）；凯基全蛋白提取试剂盒、凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；兔抗山羊PRMT1和山羊抗兔DDAH2抗体（美国Abcam公司）；小鼠抗β-action抗体（北京中杉金桥生物技术公司）。山羊抗兔及兔抗山羊和山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术公司）。化学荧光发光剂购自（美国赛默菲舍尔公司）；实验用水为超纯水。

仪器：BL－420E四道生物机能实验系统（成都盟泰科技有限公司）；TY96-ⅡN型超生细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）； H1850R型台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）； Mutiskan Go 酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；PowerPac Basic电泳仪（美国BIO-RAD公司）；培清JS-860B凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司）。

慢性心力衰竭动物模型的制备及分组：36只大鼠，随机分为3组，每组12只。异丙肾上腺素模型组皮下注射异丙肾上腺素5 mg/（kg.d）7天及生理盐水灌胃7天，建立慢性心力衰竭大鼠模型。瑞舒伐他汀治疗组皮下注射异丙肾上腺素5 mg/（kg.d）7天，并同时给予瑞舒伐他汀5 mg/（kg.d）灌胃给药14天。正常对照组给予等体积生理盐水灌胃7天。灌胃给药体积为每100 g体重0.5 ml。

血清心肌肌钙蛋白 I、脑钠肽和ADMA水平的测定：全血于6000×g离心15 min，取血清，严格按照酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒厂家说明书所述方法操作[7，8]，检测心肌肌钙蛋白 I、脑钠肽和ADMA的含量。

心功能血流动力学参数的测定：各组动物末次给药后禁食不禁水24 h，称体重，20%乌拉坦（6 ml/kg）腹腔麻醉。于颈部偏右侧行纵向切口，分离出右颈总动脉，结扎远心端，用大鼠动脉夹封闭近心端，于两端内剪开血管并插入含有肝素生理盐水（500 U/ml）的心导管（PE50）至右颈总动脉，放开动脉夹，通过压力换能器连接BL-420E四道生物机能实验系统记录仪，记录动脉血压变化：动脉收缩压、动脉舒张压、平均动脉压，稳定后记录15 min，然后沿颈动脉向心方向将导管轻轻插入3～4.5 cm，当动脉压力波形突然有大幅度的变化、舒张压明显下降时，说明导管已进入左心室，稳定后记录左心室收缩压、左心室最大上升（+LVdp/dtmax）/下降速率（-LVdp/dtmin） 、心率等。

免疫印迹方法检测相关蛋白表达：在约50 mg经液氮研磨的心肌组织中加入0.3 ml冷裂解缓冲液，冰浴下超声破碎细胞。4℃，1万r/min离心10 min，取上清蛋白定量，剩余上清液加入上样缓冲液100℃水浴10 min，-20℃保存。取蛋白样本60µg上样，10%SDS-PAGE凝胶电泳（80 V/120 V电压），200 mA恒定电流转膜至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1h后，分别用抗PRMT1抗体（1∶300）、抗DDHA2抗体（1∶300）及抗β-actin抗体（内参，1:1000）4℃孵育过夜。分别加入山羊抗兔、兔抗山羊二抗（偶联有HRP，1:3000）和山羊抗小鼠二抗（偶联有HRP，1:5000）常温孵育2 h，加入超级化学发光底物反应液，曝光胶片。胶片扫描结果采用Quantity-one软件分析，将目的条带的光密度值与其相对应的内参β-actin的光密度值相比以校正误差，所得比值代表该目的蛋白的相对含量。

病理组织学观察：切取心尖组织，置于10%中性甲醛固定24h，石蜡包埋，切片4µm，行常规苏木素伊红染色，×200镜检观察。参照文献[9]，将心肌病理损伤分为4级：0级（-）：心肌细胞结构清晰，心肌纤维排列整齐，横纹清楚，无炎细胞浸润，无细胞水肿、坏死或纤维化，间质毛细血管无扩张或轻度扩张；I级（+）：心肌细胞排列稀疏，少量炎细胞浸润、心肌细胞水肿，间质血管扩张。心肌组织可见局灶性纤维化，限于心内膜下；Ⅱ级（++）：较多炎细胞浸润，心肌细胞水肿，心肌细胞纤维化呈片状分布，累及心壁全层，间质可见明显血管扩张；Ⅲ级（+++）：有明显的间质血管扩张、水肿及炎细胞浸润，心肌广泛性大面积纤维化，灶间相互连接累及心壁全层。

统计学处理：实验结果以SPSS 11.5统计分析软件包进行分析，数据以表示，多组间均数的比较采用One-way ANOVA分析，P＜0.05为存在统计学差异的界限。

2 结果

2.1三组脑钠肽、肌钙蛋白I、ADMA及血流动力学参数变化

与正常对照组比较，异丙肾上腺素模型组脑钠肽、肌钙蛋白I含量、血清ADMA和-LVdP/ dtmin明显升高 （P均＜0.01）；左心室收缩压、心率、动脉收缩压、平均动脉压和+LVdP/dtmax均显著降低 （P均＜0.01），差异均有统计学意义。与异丙肾上腺素模型组比较，瑞舒伐他汀治疗组血清脑钠肽、肌钙蛋白I含量、ADMA水平和-LVdP/dtmin明显降低（P均＜0.01）；左心室收缩压、心率、动脉收缩压、平均动脉压和+LVdP/dtmax均显著升高 （P均＜0.01） ，差异均有统计学意义。表1

表1 三组脑钠肽、肌钙蛋白I、非对称二甲基精氨酸、血流动力学指标及PRMT1、DDAH2表达的比较（n=12，

表1 三组脑钠肽、肌钙蛋白I、非对称二甲基精氨酸、血流动力学指标及PRMT1、DDAH2表达的比较（n=12，

注：与对照组比较*P＜0.01; 与异丙肾上腺素模型组比较△P＜0.01。 PRMT1：精氨酸甲基转移酶1 DDAH2：二甲基精氨酸二甲胺水解酶2。1 mmHg=0.133 kPa

2.2免疫印迹检测结果

与正常对照组相比，异丙肾上腺素模型组PRMT1的表达增多（P＜0.01），DDAH2的表达降低（P＜0.01），差异均有统计学意义。与异丙肾上腺素模型组比较，瑞舒伐他汀治疗组PRMT1的表达明显下降 （P＜0.01）， DDAH2表达差异无统计学意义（P＞0.05）。表1、图1A、1B

2.3三组心肌组织病理切片苏木素伊红染色结果

正常对照组大鼠心肌组织无异常改变，心肌纤维排列整齐，横纹清晰，细胞核居中，间质未见血管扩张及炎性细胞的浸润；异丙肾上腺素模型组大鼠心肌细胞肥大、排列紊乱，间质可见不同程度的细胞凋亡、纤维化及炎性细胞浸润，以纤维化最为突出；瑞舒伐他汀治疗组心肌纤维化程度显著减轻，伴少量炎性细胞浸润。图2

图1 三组免疫印迹检测结果

图2 三组心肌组织病理切片苏木素伊红染色结果(×200 )

3 讨论

异丙肾上腺素可造成心肌弥漫性坏死，心肌纤维化，这种心衰模型因为没有持续存在的损伤因素（如瓣膜疾病、冠状动脉结扎、病毒等），所以能够更好地反映心衰的自然病理过程[10]。本实验采用异丙肾上腺素皮下注射的方法建立大鼠慢性心力衰模型。脑钠肽是心脏分泌的激素之一，与左心室功能关系密切，血清脑钠肽水平越高，左心室功能障碍越严重，它是诊断心力衰竭的敏感指标[11]。肌钙蛋白I是心肌内的一种调节蛋白，只存在于心肌组织中，有研究表明，慢性心力衰竭患者血清肌钙蛋白I水平明显升高[12]，说明慢性心力衰竭时存在心肌损伤。此外，左心室收缩压、左心室等容期压力最大变化速率反映了心室的收缩功能和舒张功能，它们是评价心肌舒缩性能的指标[13]。慢性心力衰竭可使左心室收缩压、+LVdP/dtmax明显降低，同时心肌肥厚及纤维化使心肌局部舒缩性能发生障碍，心肌僵硬度增加，心脏顺应性下降，心输出量随之减少。研究显示5 mg/（kg.d）异丙肾上腺素持续给药7天可出现心肌组织纤维化，心功能障碍，且其与梗死后心功能障碍及心肌肥厚相一致[14]。本实验结果显示异丙肾上腺素模型组大鼠血清脑钠肽及肌钙蛋白I含量明显升高 （P＜0.01）；心率、动脉收缩压、左心室收缩压和 LV +dP/dtmax均显著降低（P＜0.01），而-LV dP/dtmin升高 （P＜0.01）；大鼠心肌组织可见心肌细胞肥大、细胞凋亡、纤维化及炎性细胞浸润，尤以组织纤维化最为严重。与文献报道一致[6-8]。因此，本实验以异丙肾上腺素诱导大鼠慢性心力衰竭模型造模是成功的。

研究表明，脑钠肽、肌钙蛋白I是慢性心力衰竭的生物标识物，是心肌损伤高度敏感和特异的指标，心衰患者肌钙蛋白I的释放与左心收缩功能障碍有关[15]。本实验结果显示瑞舒伐他汀可降低异丙肾上腺素诱导的慢性心力衰竭大鼠血清脑钠肽、肌钙蛋白I水平，表明瑞舒伐他汀对心肌损伤具有保护作用。瑞舒伐他汀可显著改善大鼠左心室收缩、舒张功能，提示瑞舒伐他汀可改善异丙肾上腺素致慢性心力衰竭大鼠心功能。此外，从心肌病理组织切片显示瑞舒伐他汀可明显改善大鼠心肌纤维化程度，减轻心肌损伤。上述结果表明，瑞舒伐他汀对异丙肾上腺素诱导的慢性心力衰竭大鼠的心脏具有保护作用。

ADMA 是一种内源性一氧化氮合酶竞争性抑制剂，在慢性心力衰竭的发展中起至关重要的作用。临床研究表明，在慢性心力衰竭患者血清中检测到ADMA 水平增高[16]，动物实验表明，异丙肾上腺素诱导的急性心肌缺血大鼠血清ADMA水平明显增高[17]。本实验研究结果表明，异丙肾上腺素诱导的慢性心力衰竭大鼠血清ADMA含量明显增高，瑞舒伐他汀可明显降低血清中升高的ADMA水平。提示瑞舒伐他汀对大鼠慢性心力衰竭保护作用与降低血清ADMA水平有关。

研究表明，ADMA的产生与分解代谢受PRMT1/DDAH2 系统的调控。PRMT1以 S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，催化蛋白或多肽中精氨酸残基进行甲基化，甲基化蛋白在蛋白水解酶的作用下生成ADMA。二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）是内源性 ADMA 代谢的关键酶。在体内，80%以上的 ADMA 经 DDAH 水解成胍氨酸和二甲胺而被代谢，仅有少量由尿排出。DDAH又存在两个亚型：即DDAH1 和 DDAH2。DDAH2 则多存在于以内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达为主的组织如心脏、血管等。ADMA的生产和消除与PRMT1和DDAH2密切相关，PRMT1表达的降低或DDAH2表达增多均可以使体内ADMA的生成减少[18]。因此，PRMT1/ADMA/DDAH2 代谢通路失调可引起内皮功能不全、心室重构等一系列病理改变，最终导致慢性心力衰竭。本课题组研究结果表明，异丙肾上腺素组PRMT1表达明显增多，且DDAH2表达显著降低，与文献报道一致[19]。瑞舒伐他汀可降低升高的PRMT1的表达，但对降低的DDAH2表达无影响。提示瑞舒伐他汀对大鼠慢性心力衰竭的保护作用是通过降低PRMT1的表达而减少血清ADMA含量来实现的。

综上所述，瑞舒伐他汀具有保护异丙肾上腺素诱导大鼠慢性心力衰竭的作用，该作用机制与其降低血清肌钙蛋白I、脑钠肽和ADMA及调控ADMA代谢通路有关。

慢性心力衰竭是各种心血管疾病的最严重阶段，尽管他汀类药物具有治疗心衰的理论基础, 动物实验和临床实验也提示他汀类药物可改善心衰,但也有一定的不利影响。目前还缺乏大规模人群前瞻性临床资料进一步支持。随着临床对其研究的不断加大和加深, 相信他汀类药物将会在心血管疾病以及其他治疗领域中将会发挥更为广泛的作用。

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The Protective Roll of Rosuvastatin on Chronic Heart Failure in Rats With its Effect on Asymmetric Dimethylarginine Metabolic Pathway

XIONG Ai-qin, MA Ping, LIU Jun-mei, XU Ye-hua, WANG Yang, XU Qing-bin.
Graduate School of Ningxia Medical University, Yinchuan (750004), Ningxia, China

XU Qing-bin, Email: Xu-qb@163.com

Objective: To investigate the protection roll of rosuvastatin on chronic heart failure (CHF) in rats with its effect on asymmetric dimethylarginine (ADMA) metabolic pathway.Methods: A total of 36 male SD rats were randomly divided into 3 groups, n=12 in each group. Isoproterenol (ISO) group, the rats received ISO subcutaneous injection (5mg.kg.d) for 7 days to establish CHF model, and then received normal saline gavage administration for 7 days. Rosuvastatin (ROS) treatment group, the rats received ISO with ROS for 7 days, then continuously receiving ROS until 14 days. Normal control group, the rats received saline gavage administration for 7 days. The related serum index and haemodynamic parameters were examined, myocardial pathological changes were observed and the relevant protein expression was measured by Western blot analysis.Results: Compared with Normal control group, ISO group had obviously increased troponin (cTn I), serum ADMA, -LVdP/dtmin, all P＜0.01, and decreased left ventricular systolic pressure (LVSP), heart rate, arterial SP, mean arterial pressure, +LVdP/dtmax, all P＜0.01. Compared with ISO group, ROS treatment group showed signif i cantly decreasedBNP, cTn I, ADMA , -LVdP/dtmin, all P＜0.01, and increased LVSP, heart rate, arterial SP, mean arterial pressure, +LVdP/dtmax, all P＜0.01. Compared with Normal control group, ISO group had increased expression of protein arginine methyltransferases 1 (PRMT1), decreased expression of dimethyl- arginine dimethylaminohydrolase 2 (DDHA2), both P＜0.01. Compared with ISO group, ROS treatment group showed decreased expression of PRMT1, P＜0.01 and similar expression DDHA2, P＞0.05.Conclusion: Rosuvastatin has the protective roll on ISO induced CHF in rats, which might be related to decreased serum levels of cTn I, BNP and ADMA metabolic pathway regulation.

Rosuvastatin; Isoproterenol; Chronic heart failure; Asymmetric dimethylarginine; Protein arginine methyltransferases 1; Dimethylarginine dimethylamine hydrolase 2

2013-12-27）

（编辑：王宝茹）

国家自然科学基金资助项目(NO.81060024)

750004 宁夏回族自治区银川市, 宁夏医科大学研究生院 临床学院（熊爱琴、徐烨华） ，药学院（刘俊梅、王洋）；宁夏医科大学总医院心内科（马萍、徐清斌）

熊爱琴 主治医师 硕士 主要从事心血管疾病的防治研究 Email：1403201014@qq.com 通讯作者：徐清斌 Email：Xu-qb@163.com

R541.7

A

1000-3614（2014）09-0743-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.09.021

方法：36只SD大鼠，随机分为异丙肾上腺素模型组、瑞舒伐他汀治疗组、正常对照组，每组12只，建立各组模型。检测血清学相关指标和血流动力学参数，并观察心肌组织病理变化，采用免疫印迹方法检测相关蛋白表达的情况。

结果：与正常对照组比较，异丙肾上腺素模型组脑钠肽、肌钙蛋白I含量、血清ADMA和左心室最大下降速率（-LVdP/dtmin）明显升高 （P均＜0.01）；左心室收缩压、心率、动脉收缩压、平均动脉压和左心室最大上升速率（+LVdP/ dtmax）均显著降低 （P均＜0.01），差异均有统计学意义。与异丙肾上腺素模型组比较，瑞舒伐他汀治疗组血清脑钠肽、肌钙蛋白I含量、ADMA水平和-LVdP/dtmin明显降低（P均＜0.01）；左心室收缩压、心率、动脉收缩压、平均动脉压和+LVdP/dtmax均显著升高 （P均＜0.01） ，差异均有统计学意义。与正常对照组相比，异丙肾上腺素模型组蛋白精氨酸甲基转移酶1 （PRMT1）的表达增多（P＜0.01），二甲基精氨酸二甲胺水解酶2 （DDAH2）的表达降低（P＜0.01），差异均有统计学意义。与异丙肾上腺素模型组比较，瑞舒伐他汀治疗组PRMT1的表达明显下降 （P＜0.01）， DDAH2表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

结论：瑞舒伐他汀对异丙肾上腺素诱导的大鼠慢性心力衰竭心脏具有保护作用，该作用机制与其降低血清肌钙蛋白I、脑钠肽及调控ADMA代谢通路有关。