刘如俊，赵文志，张 路，王国强

(1.大连医科大学 研究生院，辽宁 大连116044;2.大连医科大学 附属第二医院 创伤骨一科，辽宁 大连116027)

全球糖尿病发病率日益增高，给人类的公共健康带来了巨大威胁。在发展中国家，足溃疡和截肢较为严重，且常合并为广泛的感染。如何治疗糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer，DFU)，引起广泛的关注，而对糖尿病足溃疡治疗的过程中，难点和焦点就集中在DFU 创面愈合差、创面愈合延迟，甚至久治不愈等。目前，关于糖尿病足部溃疡难愈合的机制尚不清楚，己知与创面细胞、细胞外基质、细胞因子、血管因素等有关。EGF 可以诱导角质细胞和纤维母细胞增生、使角质层增厚、刺激周围神经再生［1-3］。有研究表明表皮生长因子及其受体相对或绝对减少是糖尿病足溃疡难愈合的重要原因之一。本研究通过溃疡面局部应用表皮生长因子干预，观察其对糖尿病足溃疡创面愈合的促进作用，并探讨其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材 料

实验试剂:四氧嘧啶(美国Sigma 公司);高脂饲料(大连医科大学动物实验中心);RNAprep Pure Tissue Kit DP431(北京TIANGEN)。

仪器:Nano Drop ND -1000 紫外分光光度仪(美国Nano Drop 公司，TaKaRa 公司提供);凝胶成像系统(美国UVP BioSpectrum);变性梯度凝胶电泳仪(美国 伯乐);光学显微镜;投射电子显微镜(JEM-2000EX日本电子公司);核酸定量分析仪(Thermo);梯度PCR 仪(Thermo);全自动高速离心机(Thermo)。

实验对象:大连医科大学动物实验中心提供健康新西兰大白兔70 只(实验动物使用许可证:SYXK［辽］2008 -0002)，被选的实验兔体重大约在2.5 ～3.0 kg，新西兰实验兔的性别不受限制。

1.2 建立Ⅱ型糖尿病模型

高脂高糖饲料喂养新西兰兔2 个月，分别于(第1 天、第4 天、第7 天)禁食6 h 后采用耳缘静脉注射由无菌生理盐水配制的2.5%四氧嘧啶50 mg/kg，共3 次，第10 天测空腹血糖＞11.1 mmol/L 入选模型，共有32 只实验兔符合实验的纳入标准。

1.3 分组及溃疡创面治疗的实施

入选模型的32 只新西兰兔随机分成2 组，每组16 只实验用新西兰兔。在兔子大腿部造创，其标准为:实验用兔足背部切除10 mm×7 mm 矩形区域全层皮肤，一组局部创口连续涂抹表皮生长因子(EGF)，用量从始至终为1 mL，每天1 次，作为A组;另一组为不施加干预的B 组。实验过程中条件均衡、固定。

1.4 大体观察

健康新西兰大白兔糖尿病足溃疡造模后第7 和第15 天，各新西兰大白兔糖尿病足溃疡面用数码相机拍照。图像经图像处理软件PS 处理后分析计算出未愈合面积，依如下公式计算出创面愈合率:糖尿病足溃疡面愈合率=［(原创面面积-未愈合创面面积)/原创面面积)］。

1.5 Masson 染色观察

大致过程如下:先用10%的甲醛溶液固定标本，标本脱水后包埋，石蜡切片脱蜡，足量的自来水冲洗，蒸馏水反复冲洗5 次，Weigert 苏木精液染核，10 min 后将标本水洗。水洗后用Masson 丽村红酸性复红液浸泡8 min，2%冰醋酸水溶液浸1 min，1%磷钼酸水溶液分化4 min，苯胺蓝染5 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗2 min，常规用95%酒精，纯酒精，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.6 HE 染色观察

标本放入40 g/L 多聚甲醛溶液中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明及浸蜡和包蜡。切下的标本展开、烤片、脱蜡，然后脱二甲苯，梯度乙醇脱水，染色后，再次梯度乙醇脱水，完成二甲苯透明后封固，最后苏木精-伊红染色。

1.7 电子显微镜观察

组织用0.1 mol/L pH7.4 的二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛在4 ℃固定2 h 在0.1 mol/L pH7.4 的二甲砷酸钠缓冲液洗3 次，再放入用相同缓冲液配制的1% 锇酸中固定2 h。标本投入到30%、50%、70%的乙醇中，在4 ℃条件下各10 min。然后再投入到80%、90%、95%的丙酮中各10 min，100%的丙酮中2 次，每次10 min。标本由100%丙酮中移入装有混匀包埋剂的胶囊中，在30 ℃下震荡4 h。然后置于35 ℃、45 ℃、60 ℃温箱中各24 h，使包埋剂聚合，硬化，由流体变为均匀的固体。然后再切片机上切片，用铜网收集所得切片，在电子显微镜下观察。

1.8 RT-PCR 检测EGF 基因表达

RT—PCR 总 RNA 提 取 及 逆 转 录:按 照RNAprep Pure Tissue Kit DP431 试剂盒(北京TIANGEN)、大连TaKaRa 公司的反转录试剂盒和说明书获得EGFmRNA 的反转录DNA。PCR 反应条件:95 ℃变性5 min;94 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s;72 ℃延伸60 s;重复变性、退火、延伸，共35 个循环，充分延伸，72 ℃、10 min，结束温度为4 ℃。扩增产物分析:取5 微升产物在80V 电压下经2%琼脂糖凝胶电泳40 min，利用凝胶成像系统(UVP)观察、拍照，并用Gel-Pro analyzer 4.0 软件进行灰度分析(以β - actin 为内参进行扩增。β - actin 及bFGF PCR 引物序列见表1)。

表1 引物序列Tab 1 The sequence of primer

1.9 统计学方法

样本统计量采用统计分析软件SPSS13.0 软件。对照组与实验组比较前先对样本资料做正态分布检验及方差齐性检验，符合条件后做成组设计两样本t检验，实验设计为双侧t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 创面愈合率

A 组愈合迅速，创面完全上皮覆盖所需平均天数为12 d，溃疡愈合率为78%;B 组愈合缓慢，至20 d 时仍未完全上皮覆盖，溃疡愈合率仅为35%。见图1。

2.2 Masson 染色及HE 染色

各组病理切片观察结果:第15 天可见A 组肉芽生长迅速，大量成纤维细胞聚集成群，轮廓较清晰;细胞外基质丰富，胶原纤维束排列密集而有序，可见大量血管生成，组织分层愈合良好。B 组愈合缓慢，胶原纤维稀疏，组织结构不明显。见图2、图3。

2.3 两组创面组织电镜观察

第15 天A 组大体观细胞排列整齐、有序，其中成纤维细胞数目明显较多，形状完好，体积较大，细胞质内细胞器丰富。而且细胞周围可见大量胶原纤维整齐有序的排列。B 组成纤维细胞形态不规则，细胞内容物少，周围胶原纤维稀疏，排列混乱。见图4。

2.4 两组EGF mRNA 比较

A 组EGFmRNA 灰度相对值大于B 组，差异具有显著性意义，P ＜0.01。见图5、表2。

图1 两组第15 天创面愈合情况Fig 1 The situation of wound healing after 15 days in two groups

图2 两组第15 天Masson 染色观察创面组织结构(×40)Fig 2 The observation of wound in Masson trichrome staining after 15 days in two groups of wound(×40)

图3 两组第15 天HE 染色观察创面组织结构(×40)Fig 3 The observation of wound in HE trichrome staining after 15 days in two groups of wound(×40)

图4 两组第15 天透射电镜结果(×15 000)Fig 4 The results of wound observed in electron microscope after 15 days in two groups (×15 000)

图5 两组EGFmRNA 灰度对比Fig 5 Two gray contrast EGFmRNA

表2 两组EGFmRNA 相对灰度比值Tab 2 Ratio of EGFmRNA relative gray in two group

3 讨 论

国际糖尿病工作组(WGDF)将糖尿病足病定义为:糖尿病患者踝以下累计全层皮肤的创面，而与这种创面的病程无关的与局部神经异常和下肢远端外周血管病变相关的足部感染、溃疡和/或深层组织破坏的一种病变［4-5］。

糖尿病足部溃疡难愈合甚至不愈合的原因及机理目前仍然不清楚。己知与糖尿病血糖控制不佳、创面细胞、神经末梢脱髓鞘、难治性感染、细胞外基质、细胞因子和相应受体的相对和绝对缺乏、血管因素等有关［6］。表皮生长因子(EGF)是促进创面伤口愈合的重要生长因子之一，而且是第一个被用来研究创面愈合的生长因子［7］。表皮生长因子(EGF)的研究不断开展，细胞培养证实，表皮生长因子有促进细胞有丝分裂、促进糖酵解的功能，更为重要的是对表皮细胞DNA、RNA 的复制和转录有刺激作用，对蛋白质的翻译合成也有一些刺激作用［8］。EGF 可以诱导角质细胞和纤维母细胞增生、使角质层增厚、刺激周围神经再生［2-3，6］。EGF 不仅参与细胞增殖、迁移和分化功能的调节，而且是有效的促细胞分离原［9-11］。表皮生长因子(EGF)对表皮细胞DNA、RNA 的复制和转录有刺激作用，对蛋白质的翻译合成也有一些具有刺激作用［12］。同时，EGF有明显的趋向活性，诱导炎性细胞向创面部位移动、改善创面微环境和组织营养状态;EGF 还能刺激纤维结合素的产生以及通过增加创面局部成纤维细胞的数量来促进皮肤的增生［13］。2009年有一项多中心、双盲实验。实验是以安慰剂为对照组，评价了对瓦格纳分级为3 ～4 级DFU 患者对局部注射rhEGF的疗效，实验结果为同因素不同水平的实验组与安慰剂的对照组比较P ＜0.05，有统计学意义［14］。本实验光镜下可见表皮生长因子组肉芽生长迅速，大量成纤维细胞聚集成群，轮廓较清晰;细胞外基质丰富，胶原纤维束排列密集而有序，可见大量血管生成，组织分层愈合良好。对照组愈合缓慢，胶原纤维稀疏，组织结构不明显。电镜下的结果显示表皮生长因子组成纤维细胞体积大，形态完好，胞质内细胞器丰富。细胞周围可见大量胶原纤维，排列整齐、有序。糖尿病对照组成纤维细胞形态不规则，细胞内容物少，周围胶原纤维稀疏，排列混乱。A 组愈合迅速，创面完全上皮覆盖所需平均天数为12 d，溃疡愈合率为78%;B 组愈合缓慢，至20 d 时仍未完全上皮覆盖，溃疡愈合率仅为35%。本实验研究初步表明，表皮生长因子干预的糖尿病足模型组，肉芽生长迅速、大量成纤维细胞聚集成群;细胞外基质丰富、胶原纤维束排列密集而有序、可见大量血管生成、组织分层愈合良好，而对照组未见。提示表皮生长因子在糖尿病足溃疡创面愈合过程中具有积极作用［15-16］。

糖尿病足溃疡面难愈合的一个重要因素就是糖尿病足创面的组织和细胞生长因子(GF)及其受体相对或绝对缺乏，实验证明可以显著提高溃疡愈合率的方法之一就是局部运用有活性的生长因子(GF)［9］，例如表皮生长因子，血管内皮生长因子，胰岛素样生长因子等。EGF 主要是由血小板、巨噬细胞、单核细胞所分泌［17］，受体结合分析表明，大部分细胞表面都含有EGF 的受体蛋白［18］。血小板、巨噬细胞、单核细胞分泌的EGF 和表皮细胞及成纤维细胞膜相应的受体蛋白结合，主要参与细胞的增殖、迁移和分化功能的调节。实验已经发现EGF 在临床上有促进创面愈合的效果，但是其作用机理在分子及信号转导方面不是很清楚。本实验EGFmRNA分析的结果，A 组EGFmRNA 的灰度相对值为109.31 ±5. 17;B 组EGFmRNA 的灰度相对值为61.59 ±4.61。两样本数据都符合正态分布且方差齐性，差异有显著性意义(P ＜0.01)。实验初步说明实验组的内源性EGF 的表达高于对照组内源性EGF 的表达，说明实验因素是和观察指标(内源性EGFmRNA)相关的。可能的原理为外源性EGF 可能促进了内源性EGF 的表达，其上调了局部EGF基因的表达［19-20］。这种假设需要做进一步的单因素多水平的实验设计后回归分析。外源性的表皮生长因子(EGF)可以促进EGFmRNA 的转录和翻译，EGFmRNA 更好地得到基因表达，从而刺激组织分泌EGF，分泌的EGF 和表皮细胞及成纤维细胞膜相应的受体蛋白结合，主要参与细胞的增殖、迁移和分化功能的调节。完成胶原组织构建，加速创面肉芽组织生成和上皮组织的形成，加速创面愈合速度，达到创面愈合质量［14，19-20］。

表皮生长因子在促进创面愈合方面已经显示出了积极的作用。但是，此外EGF 的应用还有需要解决的问题，比如用药剂量和方法［21］，创面的评估和如何清创，会不会诱导肿瘤的发生等。在有效的控制血糖的基础上，需要客观的分析，运用“创面床准备(wound bed preparation，wbp)”理论，对创面的形成时间长短不同、创面大小及溃疡程度不同、不同阶段实施不同的干预会收到更好的治疗效果［22］。外源性EGF 是如何促进内源性EGF 表达的，信号转导的途径需要进一步探究。外源性GF 半衰期短，局部使用之后很快被稀释和降解，需反复大量使用，且价格昂贵。

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