张 艳，王金鸿，吕亚莉，菅复春，张龙现，宁长申

（河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002）

六种试剂盒提取血液基因组DNA效果比较

张 艳，王金鸿，吕亚莉，菅复春，张龙现，宁长申

（河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002）

为筛选一种高效、快捷的血液基因组DNA提取试剂盒，采集24份新鲜西藏绵羊血液样本，选用6种市售商业化试剂盒（LifeFeng柱式试剂盒DK601和非柱式试剂盒DK602，康为世纪非柱式试剂盒CW0544和柱式试剂盒CW0546，上海生工非柱式试剂盒SK8224和柱式试剂盒SK8254）,比较所提DNA的浓度、纯度、得率以及对嗜吞噬细胞无形体16S rRNA进行巢式PCR扩增，综合评价不同试剂盒DNA提取效果。结果表明，应用LifeFeng柱式试剂盒DK601提取的DNA浓度和纯度均最高，得率较高，分别达到75.63 ng/μL、1.894（OD260/OD280）、18.91 ng/μL；且嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因的PCR扩增条带清晰度最优。因此，LifeFeng DK601可作为提取绵羊血液基因组DNA及嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）病原鉴定的首选试剂盒。

DNA提取试剂盒；血液基因组DNA；PCR

聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学诊断技术［1-2］，而该技术依赖于高质量的DNA样本。因此，提取到高质量、纯度好、结构完整的DNA对于分子生物学试验至关重要。目前除了经典的苯酚氯仿抽提法、异丙醇沉淀法外，还建立了玻璃珠吸附法、三乙醇胺月桂基硫酸盐法、盐析法等DNA提取方法［3］。不同DNA提取方法具有不同的特点。

依据相关的DNA提取原理，目前已开发出了数量众

多的DNA提取试剂盒。如基于异丙醇沉淀法，上海LifeFeng、北京康为世纪、上海生工等国内著名的生物技术公司分别推出了以DK602、CW0544、SK8224等为主的试剂盒。基于硅胶吸附原理，上述3家公司分别生产了DK601、CW0546、SK8254等产品。目前这些商业化基因组DNA提取试剂盒已得到广泛应用，但由于不同试剂盒因DNA提取的原理、技术水平及产品质量不同，其成本也有所不同。另外，由于试验目的不同，研究者对DNA质量和数量的要求也有所不同。在临床和科研工作中，受采集条件所限，采集到的血液样品的量通常较少。因此，筛选高效、快捷且适用于提取少量血液样本的DNA提取试剂盒非常关键。本研究使用市场上常见的几种血液基因组DNA提取试剂盒对绵羊血液基因组DNA的提取效果进行比较，旨在确定适合检测本实验室病原嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）的试剂盒，为相关的绵羊分子生物学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

24份血液样品采自河南省驻马店市确山县竹沟镇奥森生态羊养殖专业合作社饲养的6～7月龄的西藏绵羊，4℃冰箱内保存2 d。嗜吞噬细胞无形体阳性DNA为本实验室保存。

1.2 试剂

上海LifeFeng非柱式（DK602）和柱式（DK601）血液DNA提取试剂盒、北京康为世纪非柱式（CW0544）和柱式（CW0546）血液DNA提取试剂盒、上海生工非柱式（SK8224）和柱式（SK8254）分别购自郑州道合伟业生物科技有限公司、郑州畅佳商贸有限公司、郑州鑫励扬生物科技有限公司。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。PCR反应使用的酶、dNTPs、缓冲液等为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.3 仪器

ABI 2720型PCR仪购自杭州朗基科学仪器有限公司，DYY-5型电泳仪及电泳槽购自北京市六一仪器厂，凝胶成像系统购自英国Syngene公司，NanoDrop2000紫外分光光度计购自美国ThermoFisher公司。

1.4 方法

1.4.1 血液基因组DNA提取 使用6种试剂盒提取24份新鲜血液样品的DNA，每份均使用200 μL血样，依据试剂盒说明书进行操作。提取DNA后，应用紫外分光光度计测定DNA浓度和OD260/OD280值，并根据公式计算出DNA得率（ng/μL）=DNA浓度（ng/μL）×DNA体积（μL）/取材量（μL）［3］。

1.4.2 嗜吞噬细胞无形体16S rRNA巢式PCR扩增验证

参照Barlough等［4］报道的引物EE1和EE2扩增无浆体16SrRNA基因，该引物具有无浆体属特异性。种特异性引物SSAP2参照Kawahara等［5］扩增嗜吞噬细胞无形体时所用引物。PCR反应体系为25 μL，其中灭菌去离子水18.25 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mM）2 μL，上下游引物各0.5 μL（25 μmol/L），LATaq（5 U/μL）0.25 μL, DNA模板1 μL。第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR产物。反应条件均为94℃预变性5 min，94℃变性40 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物于-20℃保存，取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳。每个试验重复3次。

1.5 数据统计分析

将不同试剂盒提取的样品DNA浓度、纯度和得率均以M±SD表示，用GraphPad Prism软件进行方差分析，多重比较采取Duncan氏法进行。

2 结果与分析

2.1 6种试剂盒提取基因组DNA的效果比较

从表1和图1可见，使用相同量的血液样本，上海LifeFengDK602和北京康为世纪CW0544两种非柱式提取试剂盒提取的DNA的平均浓度相对较低，各样本浓度均低于40 ng/μL，且样本间变异较小。上海生工的SK8224非柱式提取试剂盒提取的DNA平均浓度虽然较高，但大部分样品的浓度在20 ng/μL以下，但样本间差异很大，说明该试剂盒提取效果很不稳定。在3种柱式提取试剂盒中，上海LifeFengDK601的DNA浓度最高，是其他柱式试剂盒及非柱式试剂盒的2～3倍，且稳定性较好。其他2种柱式试剂盒（北京康为世纪CW0546和上海生工SK8254）与3种非柱式试剂盒提取的DNA浓度接近或略高，但上海生工SK8254柱式试剂盒的稳定性较差。

应用不同试剂盒提取的DNA纯度和得率也有一定差异。相对而言，北京康为世纪CW0544非柱式试剂盒提取的DNA纯度最低，而上海LifeFengDK601柱式试剂盒提取的DNA纯度最高，说明该试剂盒提取的DNA质量最好。上海生工SK8224非柱式试剂盒得率最高，上海LifeFengDK601柱式试剂盒得率次之，而两种柱式试剂盒（北京康为世纪CW0546和上海生工SK8254）得率最低。

不同试剂盒提取DNA的成本和耗时也不同。3种非柱式试剂盒成本较低，上海LifeFengDK601柱式试剂盒成本属于中等，而另两种柱式试剂盒成本很高。在提取时间方面，3种非柱式试剂盒花费时间较多，而3种柱式试剂盒所需时间相对较少。

表1 6种试剂盒提取基因组DNA的浓度、纯度和得率

图1 不同试剂盒DNA浓度散点图

2.2 6种试剂盒提取基因组DNA的PCR验证结果

对6种试剂盒提取的基因组DNA进行巢式PCR扩增，得到嗜吞噬细胞无形体的16S rRNA基因的结果见图2。从图2可见，在均取1 μL DNA作为模板进行PCR的情况下，在非柱式提取法中，上海LifeFeng DK602的目的条带最亮，上海生工SK8224的亮度次之。在柱式提取法中，上海LifeFeng DK601和上海生工SK8254的目的条带清晰，亮度相当，而康为世纪CW0546的效果较差。

图2 6种试剂盒提取DNA的PCR扩增电泳结果

3 小结与讨论

目前提取DNA的方法很多，不同方法各有优缺点。异丙醇沉淀法的优势是简便快捷，实验成本低，得到的DNA量较大，且对实验设备要求不高，然而该方法提取的DNA因未经后续纯化，可能混杂有少量RNA和蛋白质，因此得到的DNA纯度有限，通常此法提取的DNA其OD260/OD280值小于1.8。相对于传统的异丙醇沉淀法，目前大量商业化的DNA提取试剂盒多采用硅胶吸附原理来抽提DNA，该方法因其可高效快速提取到高纯度DNA而受到广大科研和临床工作人员的青睐，尽管此方法得到DNA的数量较少。

本研究选择6种试剂盒提取基因组DNA，并根据所得DNA的浓度、纯度和得率以及PCR扩增嗜吞噬细胞无形体16SrRNA的效果来评价DNA质量。在3种非柱式提取法试剂盒中，上海生工试剂盒SK8224提取的DNA平均浓度最高，但提取结果稳定性差；上海LifeFeng试剂盒DK602提取的DNA经巢式PCR扩增得到的条带最亮，且成本最低。然而3种非柱式提取法试剂盒提取的DNA其OD260/OD280值均未小于1.8，说明这些DNA可能有蛋白质污染。3种柱式提取法试剂盒提取的DNA其OD260/OD280值均高于非柱式，上海LifeFeng试剂盒DK601提取的DNA浓度、纯度和得率在3种柱式产品

中最好，并且稳定性在6种试剂盒中也较高，嗜吞噬细胞无形体16SrRNA巢式PCR的条带亮度也印证了这一结果。综上所述，在对DNA纯度要求较高的情况下，上海LifeFeng柱式血液基因组DNA提取试剂盒DK601较适合，而如果对DNA纯度要求不高且需检测大量样本的情况下，如在进行分子流行病学调查试验中，上海LifeFeng非柱式血液基因组DNA提取试剂盒DK602较适合，因其花费的成本较低且PCR扩增效果也很好。总的来说，这两种试剂盒均适用于本实验室提取绵羊血液基因组DNA并扩增嗜吞噬细胞无形体。

［1］高健，刘海，周玉财，等.奶牛乳房炎病原菌的PCR诊断技术研究进展［J］.中国奶牛，2013（4）:31-33．

［2］梁民，蒋柳平，黄溢泓，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用［J］.南方农业学报，2011，42（8）：991-994．

［3］张宁，王凤山.DNA提取方法进展［J］.中国海洋药物，2004（2）：40-46．

［4］Barlough J E，Madigan J E，DeRock E，et al.Nested polymerase chain reaction for detection of Ehrlichia equi genomic DNA in horses and ticks（Ixodespacificus）［J］.Veterinary Parasitology，1996，63（3-4）：319-329.

［5］Kawahara M，Rikihisa Y，Lin Q，et al.Novel genetic variants of Anaplasma phagocytophilum，Anaplasma bovis，Anaplasma centrale，and a novel Ehrlichia sp.in wild deer and ticks on two major Islands in Japan［J］. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（2）：1102-1109.

Comparison of DNA Extraction Effects by 6 Blood Genomic DNA Extraction Kits

Zhang Yan，Wang Jin-hong，Ning Chang-shen，et al
（College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China）

In order to select a relatively better DNA extraction kit for the extraction of genomic DNA,fresh blood samples were taken from 24 Tibetan sheep，and 6 commercial kits，including the LifeFeng DNA extraction kit DK601 and 602，CWBIO DNA extraction kit CW0544 and CW0546，Sangon DNA extraction kit SK8224 and SK8254，were chosen as the DNA extraction reagents.The qualities ofextracted DNAs were evaluated by determination of the concentrations，the purities and extraction rates，as well as the effects of nested PCR targeted for the Anaplasma phagocytophilum 16S rRNA gene.The results showed that the highest DNAconcentration，purityand extraction rate，which came up to75.63 ng/μL，1.894（OD260/OD280）and 18.91 ng/μL，respectively，could been achieved byemployingthe LifeFengDNAextraction kit DK601.Furthermore，the best results ofPCR reaction were observed usingthe DNAsamples harvested fromthis kit.It therefore been concluded that the LifeFengDNAextraction kit DK601 was the relativelybetter reagent for the genomic DNAextraction and detection of Anaplasma phagocytophilum from the blood in sheep research.

DNAextraction kit；blood genomic DNA；PCR

S826.2

A

2095-3887（2014）02-0009-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.002

2014-02-18

国家现代肉羊产业技术体系建设专项（nycytx-39）

张艳（1986-），女，博士研究生。

宁长申（1958-），男，教授。