曹一波，于 君，马 晶，金 晨，马亚辉，金 纬，丁玉珀，侯英泊

姜黄素对胶质瘤U87细胞增殖和迁移能力的影响

曹一波，于 君，马 晶，金 晨，马亚辉，金 纬，丁玉珀，侯英泊

目的探讨姜黄素对胶质瘤细胞系U87细胞增殖及迁移能力的影响。方法 应用CCK-8比色法检测经正常培养液及含不同浓度(25、50、100μmol/L)姜黄素的培养液培养24、48、72 h后的U87细胞的存活率;应用细胞划痕实验检测100μmol/L姜黄素对U87细胞迁移能力的影响;将20只SD大鼠制备成胶质瘤模型，随机分成对照组及实验1、2、3组，每组5只，模型制备后第7天对照组给予生理盐水灌胃，实验1、2、3组分别给予姜黄素100、200、300 mg/kg灌胃，1/d，连续14 d，第15天用microPET-CT对载瘤大鼠肿瘤体积进行测定。结果 U87细胞存活率随着培养液中姜黄素浓度的升高和培养时间的延长而降低(P＜0.05);给予100μmol/L姜黄素的培养液培养24和48 h后U87细胞迁移度均低于空白对照组(P＜0.05);实验2、3组肿瘤体积均小于实验1组和对照组(P＜0.05)。结论 姜黄素可抑制胶质瘤U87细胞的增殖及迁移。

姜黄素;胶质瘤;增殖;迁移;大鼠，Sprague-Dawley

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤［1］，因其具有较强的增殖、迁移和侵袭能力，使胶质瘤患者的存活时间及存活率降低［2］，现有的治疗手段尚未能明显地改善患者的预后［3］。目前治疗胶质瘤研究的主要目标是抑制肿瘤细胞的侵袭及增殖。姜黄素是由植物合成的天然多酚，广泛存在于多种植物中，研究发现姜黄素具有多种生物活性，包括抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒、抗真菌以及抗肿瘤的作用［4］。有研究发现姜黄素能够通过抑制肿瘤转录因子-κ以及表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达起到抑制大鼠C6胶质瘤生成的作用［5］。本实验重点探讨姜黄素对胶质瘤细胞系U87细胞增殖及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SD雄性大鼠20只，体重280～300 g(第四军医大学实验动物中心提供);CCK-8(Dojindo研究所);U87细胞系(第四军医大学神经外科研究所惠赠);胎牛血清(Hyclone公司);姜黄素(Sigma公司);杜伯改良的依格培养基(DMEM，Gibico公司);胰蛋白酶(Gibico公司);microPET-CT(通用公司);酶联免疫仪(华东电子管厂)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将U87细胞系常规培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，放置在饱和湿度、37℃、含5%CO2的培养箱中进行培养，每3 d进行传代1次。

1.2.2 细胞存活率检测(CCK-8比色法):取对数生长期U87细胞，将浓度调整为1×105个/ml，接种到96孔板中，每孔200μl。正常条件下培养24 h后，处理组分别用含有25、50和100μmol/L的姜黄素培养液培养，空白对照组加入正常培养液培养，每组设5个平行孔，置于培养箱中继续培养24、48、72 h后，每孔加入 20μl的 CCK-8溶液(水浴至37℃)，再培养1 h，用酶联免疫检测仪检测450 nm波长时的吸光度值。计算不同浓度条件下姜黄素作用24、48及72 h后U87细胞的存活率。

1.2.3 细胞划痕实验:将对数生长期的U87细胞传代，接种在6孔板中，正常培养，在单层细胞长满培养板底面积约80%时，用无菌消毒的20μl加液器枪头均匀做划痕，用磷酸盐缓冲液轻柔冲洗去细胞碎片，使用无血清培养液进行常规培养24 h，更换细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM)，处理组培养液含姜黄素浓度为100μmol/L，空白对照组不加姜黄素，继续培养24和48 h，每组设5个平行孔，在倒置显微镜下观察，测量细胞迁移的程度，照相记录，计算迁移度，迁移度(%)=(划痕时两侧距离－检测时两侧距离)/划痕时两侧距离×%。

1.2.4 microPET-CT测量胶质瘤模型大鼠肿瘤体积

1.2.4.1 大鼠胶质瘤模型的制备:将SD大鼠麻醉后固定于立体定向仪上，消毒、铺巾，取内眦连线中点向后纵向切开头皮1 cm，分离充分暴露颅骨。采用Batker法确定右侧尾状核靶点，于冠状缝前1 mm、中线右侧旁开3 mm，用牙科钻钻孔，直径为1．2 mm，达硬脑膜表面，不可伤及脑组织。用25μl微量注射器抽取U87细胞悬浮液10μl，以1μl/min的速度匀速注入，注射完毕后留针5 min，缓慢退针，医用明胶海绵填充骨孔，骨蜡封闭，缝合皮肤［6］。

1.2.4.2 分组及治疗方法:将20只胶质瘤模型大鼠随机分成对照组及实验1、2、3组，每组5只。从模型制备后第7天开始对照组给予生理盐水灌胃，实验1、2、3 组分别给予姜黄素 100、200、300 mg/kg灌胃，1/d，连续14 d。第15天用microPET-CT测量肿瘤体积［7］。

1.3 统计学分析 应用SPSS 16．0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用多因素方差分析，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 不同浓度姜黄素及作用时间对U87细胞存活率的影响 随着培养液中姜黄素浓度的增加，U87细胞的存活率逐渐降低(P＜0.05)，且不同浓度姜黄素组U87细胞存活率随时间的延长而降低(P＜0.05)，见表1。

表1 不同浓度姜黄素及作用时间对U87细胞存活率的影响(±s，%)

表1 不同浓度姜黄素及作用时间对U87细胞存活率的影响(±s，%)

注:空白对照组加入正常培养液;与空白对照组比较，a P＜0.05;与25μmol/L姜黄素组比较，c P＜0.05;与50μmol/L姜黄素组比较，e P＜0.05;与本组24 h比较，g P＜0.05;与本组48 h比较，i P＜0.05

24 h 48 h 72 h 100 μmol/L 姜黄素组 5 67．01 ±23．32ace 51．51 ±10．31aceg 27．14 ±6．14组别 孔数aceig 100．00 ±9．07 100．00 ±16．13 100．00 ±14．29 50 μmol/L 姜黄素组 5 84．37 ±9．40ac 67．93 ±19．13acg 47．52 ±15．07acig 25 μmol/L 姜黄素组 5 95．66 ±9．92a 75．42 ±13．16ag 53．80 ±15．01aig正常对照组5

2.2 100μmol/L姜黄素对U87细胞迁移度的影响

处理组培养24和48 h后U87细胞迁移度均低于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 100μmol/L姜黄素对U87细胞迁移度的影响(±s，%)

表2 100μmol/L姜黄素对U87细胞迁移度的影响(±s，%)

注:空白对照组加入正常培养液，处理组加入含100μmol/L姜黄素的培养液;a P＜0.05

组别 孔数24 h 48 h处理组 5 1．64 ±0．96a 1．04 ±0．57a 5 3．10 ±0．76 7．38 ±2．93空白对照组

2.3 不同浓度姜黄素对肿瘤体积的影响 对照组及实验1、2、3组第15天测得肿瘤体积分别为(500.80 ±63.52)、(471.80 ±79.70)、(328.80 ±55.29)和(253.20 ±70.08)mm3。实验2、3 组肿瘤体积均小于对照组和实验1组，差异有统计学意义(P＜0.05);实验1组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);实验2组和实验3组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

胶质瘤是颅内常见肿瘤，尤其是胶质母细胞瘤，为恶性程度极高的中枢神经系统肿瘤，具有高增殖能力和耐放疗及化疗的特点，临床治疗受到极大的限制［8］。近些年植物提取药物正成为新药开发的一种简捷途径，姜黄素是一种纯天然的多酚类化合物，有关姜黄素治疗胶质瘤的研究也有了新的发现，如姜黄素能通过作用细胞自噬以及与肿瘤迁移相关的LN18途径达到抑制胶质瘤增生和迁移的目的［9-11］，对多种肿瘤细胞有明确的毒性作用［12-13］。多项实验研究发现，姜黄素能够通过 p53、PTEN、PI3K/Akt、Caspase-3、NF-κB 以及 p65 等分子通路实现抑制肿瘤细胞生长和迁移的作用［14-15］。同时，姜黄素能够通过水分子通路途径对创伤后脑水肿起到保护作用［16］，这是其他抗肿瘤药物所不具有的特征，在脑胶质瘤手术治疗前联合使用姜黄素可减轻术后脑水肿。因此，姜黄素可以作为治疗胶质瘤理想的化疗辅助药物。

本研究结果显示，姜黄素能明显降低胶质瘤细胞存活率，随着培养液中姜黄素浓度的增加，U87细胞的存活率逐渐降低，且不同浓度姜黄素组U87细胞存活率随时间的延长而降低;通过划痕实验证实，给予含有100μmol/L姜黄素的培养液培养24和48 h后细胞迁移度均低于空白对照组;进一步研究显示，姜黄素能够抑制载瘤大鼠胶质瘤的生长，但无明显的量效关系，即随着给予姜黄素剂量的增加其抑制肿瘤生长的作用无明显增加，其原因尚未明确。

姜黄素能够通过多条细胞通路对肿瘤细胞生长及迁移起到抑制作用，而对胶质瘤U87细胞的迁移及生长抑制作用的确切分子途径尚不明确。基质金属蛋白酶(MMPs)对胶质瘤细胞侵袭及转移起关键作用，因为这类酶能分解细胞间基质中各种蛋白，破坏组织学屏障，从而利于肿瘤细胞的侵袭［17］。因而，抑制瘤细胞内MMPs活性有助于抑制胶质瘤细胞的侵袭及扩散。有研究发现，姜黄素能够通过抑制MMPs活性进一步起到抑制胶质瘤迁移的作用［18］。而其对U87细胞的存活率以及载瘤大鼠肿瘤生长的抑制作用机制尚不明确，有待进一步研究证实。

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Effects of Curcum in on Cell Proliferation and Migration Ability of Glioma U87 Cells

CAO Yi-bo，YU Jun，MA Jing，JIN Chen，MA Ya-hui，JINWei，DING Yu-po，HOU Ying-bo(Department of Neurosurgery，Tianjin Sanatorium of Beijing Military Area command，Tianjin 300381，China)

ObjectiveTo explore the effects of Curcumin on cell proliferation and migration ability of glioma U87 cells．MethodsSurvival rates of glioma U87 cells，cultured by normal culture solutions and different concentrations(25，50 and 100μmol/L)Curcumin solutionwere detected using CCK-8 assay after culturing for24 h，48 h and 72 h;effect of cellmigration by 100μmol/L Curcumin solution was assessed using cell scuffing test;20 Sprague-Dawley(SD)ratswere randomly divided into control group(n=5)and three experimentgroups(group A，group B，group C，each n=5)after establishing gliomamodels．The 7thd after establishingmodels，control group was lavaged with saline solution，and group A，B and Cwas lavaged with 100，200 and 300mg/kg Curcumin solution respectively，(1 time/d)for14 d．Tumor volumesweremeasured on the 15thd usingmicroPET-CTmethod．ResultsSurvival rates of glioma U87 cellswere decreased with elevated Curcumin concentration and lengthened cultivation time(P＜0.05);level of U87 cell migration was lower than that in control group after being cultured with Curcumin solution(100μmol/L)for24 h and 48 h(P＜0.05);tumor volumes in group B and Cwere smaller than those in group A and control group(P＜0.05)．ConclusionCurcuminmay inhibit the cell proliferation and migration in glioma U87 cells．

Curcumin;Glioma;Proliferation;Migration;Rat，Sprague-Dawley

R730;R-332

A

2095-140X(2014)05-0019-03

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．05．005

300381天津，北京军区天津疗养院神经外科

2014-01-16 修回时间:2014-02-10)

·论著·