李晓玲，朱旅云，宋光耀，邢邯英，刘素蕊，王 超

腺病毒介导血管内皮生长因子转染脐带间充质干细胞的实验研究

李晓玲，朱旅云，宋光耀，邢邯英，刘素蕊，王 超

目的探讨腺病毒载体介导血管内皮生长因子(VEGF)转染脐带间充质干细胞(UCMSCs)的可行性，以及VEGF转染对UCMSCs功能的影响。方法 构建VEGF165-EGFP基因重组腺病毒载体，分离和培养UCMSCs，携增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒载体转染UCMSCs，倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果，流式细胞仪检测细胞转染率，确定最佳病毒感染复数(MOI)。将细胞分为VEGF-EGFP转染组、EGFP空载组及对照组3组，依据最佳MOI值转染并收集细胞，采用蛋白印迹法(Western blotting)检测VEGF及Akt表达变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF蛋白表达情况。采用CCK-8法评价转染对UCMSCs增殖的影响。结果 腺病毒介导的VEGF165-EGFP基因能够成功转染UCMSCs，且VEGF基因在细胞内能够转录和表达，并能分泌到细胞外。转染后48 h VEGF-EGFP转染组VEGF、Akt水平显著高于EGFP空载组和对照组(P＜0.05);转染后48 h采用ELISA法在VEGF-EGFP转染组细胞培养上清中即检测到VEGF的表达和分泌，在转染后第4天达到高峰，且VEGF表达显著高于EGFP空载组及对照组(P＜0.01)，以后逐渐下降，并稳定表达一定时间。CCK-8法检测结果显示，介导VEGF基因转染的腺病毒对UCMSCs增殖无明显影响。结论 腺病毒介导VEGF基因能够成功转染UCMSCs，保持其原有生物学特性，并能持续高效表达VEGF，为通过VEGF基因联合UCMSCs治疗获得糖尿病下肢血液循环重建的可行性提供理论依据。

血管内皮生长因子类;脐带间质干细胞;腺病毒载体;转染

研究发现血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能加速侧支循环的建立，在血管新生中起关键作用，但由于VEGF属多肽类生长因子，在体内半衰期短，提纯较为困难，不适合作为药物直接用于临床。高增殖潜能和定向归巢特性使脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSCs)成为促进血管新生和基因治疗缺血性疾病的理想靶细胞和种子细胞，在体细胞转染目的基因治疗中的作用越来越受到关注。本研究利用基因工程拟选择分泌型hVEGF-165作为转入基因，携增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluores centprotein，EGFP)构建质粒，通过腺病毒转染到UCMSCs细胞中，观察转染后UCMSCs理化特性、VEGF基因表达及对生长增殖的影响，为下一步研究UCMSCs联合VEGF基因治疗下肢缺血性病变的可行性及作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 EGFP及VEGF165基因重组腺病毒(病毒滴度1．57×1010pfu/ml)由广州赛生生物公司提供;DMEM/F12培养基购自美国HYClone公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;胰蛋白酶/EDTA消化液购自美国HYClone公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁公司，DMSO购自德国WAK-CHEMIE公司;ELISA VEGF试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司，批号:ZDZIBZAB01)，蛋白激酶B(Akt)多克隆抗体购自Abcam公司。酶标仪(Rayto RT-6100);Epics XL流式细胞仪购自美国BECKMAN公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分离和培养UCMSCs:无菌条件下取足月妊娠分娩胎儿的脐带(家属签署知情同意书)，用生理盐水洗涤去除血液。将脐带剪切成1～2 cm大小的片段，剔除血管(1条脐静脉、2条脐动脉)避免内皮细胞污染。取出其中的华通胶剪碎，大小约1 mm3，将组织块置于培养瓶中，加入含有10%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100 U/L链霉素的DMEM/F12培养基，放置在37℃、5%CO2培养箱中培养。1周后首次换液，此后3～4 d换液1次。待细胞长至80%～90%融合时用胰蛋白酶/EDTA消化液消化传代，显微镜下控制消化时间。

1.2.2 EGFP转染UCMSCs转染率测定:选取第3代UCMSCs接种于6孔培养板，单层培养达80%融合时，将培养液更换为α-MEM无血清培养基，按病毒感染复数(multiplicities of infection，MOI)分别为0、100、200、300、400、500，每个MOI值条件设3 个复孔，转染6 h后，将培养液更换为DMEM培养基(含10%FBS)，置入5%CO2培养箱37℃条件下培养。转染后24、48 h在荧光倒置显微镜下观察细胞EGFP的表达情况。以0．25%胰蛋白酶－乙二胺四乙酸(EDTA)消化收集细胞，用DMEM培养基洗涤细胞1次(PBS离心洗涤3次)，重悬于20 g/L多聚甲醛中，流式细胞仪检测转染细胞比例，确定最佳MOI值。

1.2.3 UCMSCs转染后VEGF基因及其下游基因表达情况的检测:将细胞分为VEGF-EGFP转染组、EGFP空载组和对照组3组。单层培养达80%融合时，依次加入纯化的VEGF-EGFP和EGFP基因重组腺病毒液，对照组以不含血清的DMEM培养基代替腺病毒液。①蛋白印迹法(Western blotting)鉴定VEGF、Akt的表达:最佳MOI值及过表达效果最好的时间点确定后，按条件转染并收集细胞。分别提取细胞的RNA和总蛋白，用实时聚合酶链反应(PCR)和Western blotting检测VEGF的表达量及下游靶基因AktmRNA水平变化。②ELISA法测定培养上清中VEGF的含量:分别在VEGF-EGFP基因转染 UCMSCs后第2、4、7、10、13 天提取细胞培养上清液进行VEGF的ELISA检测(按照试剂盒说明书操作)，在检测波长为450 nm、校正波长570 nm酶联仪上读取吸光度值，根据标准品测定结果，计算被检测细胞培养上清液内VEGF含量。

1.3 采用CCK-8法检测VEGF转染后对UCMSCs细胞增殖的影响 按上述最佳MOI转染细胞后24、48、96 h消化并收集细胞。接种于96孔板中，每组均设6个复孔。孵育过夜，按照CCK-8试剂盒流程处理细胞。选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上读取吸光度值。

1.4 统计学处理 应用SPSS 18．0软件进行统计学分析，所有数据采用均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，α=0．05为检验水准。

2 结果

图1 腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染脐带间充质干细胞后24、48 h倒置荧光显微镜下细胞形态(×100)

2.1 EGFP转染UCMSCs转染率测定 细胞在转染后24 h，荧光显微镜下不能很明显地看到绿色荧光，转染48 h后则可在荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光，见图1。

流式细胞仪检测结果:在MOI为100、200、400、500 条件下，转染率分别为 48．2%、69．0%、76．1%、91．7%、94．0%，在 MOI为 400时，转染率趋于稳定，并保持在90%以上，当MOI＞400时，转染率不再增加，细胞出现变圆、脱落，荧光碎片数量增多。故确定最佳MOI值为400。见图2。

图2 不同病毒感染复数条件下腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染脐带间充质干细胞后转染率

2.2 转染UCMSCs后VEGF基因及其下游基因表达情况

2.2.1 Western blotting检测 VEGF、Akt的表达:腺病毒介导VEGF转染UCMSCs 48 h，VEGF、Akt在各组中均有表达，但表达量不同。VEGF-EGFP转染组VEGF表达(1．71±0．13)显著高于 EGFP 空载组(1．02 ±0．11)及对照组(0．96 ±0．08)，差异有统计学意义(P＜0.05);VEGF-EGFP转染组Akt表达(1．64 ±0．12)显著高于 EGFP 空载组(1．07 ±0.09)及对照组(0．89±0．07)，差异有统计学意义(P＜0.05);而EGFP空载组与对照组VEGF、Akt表达差异无统计学意义(P＞0.05)。见图3。

2.2.2 ELISA法检测VEGF的表达:在转染后第2、4、7、10、13天采用ELISA法检测培养上清中VEGF含量，随着时间延长VEGF-EGFP转染组的含量均显著高于对照组和 EGFP空载组(P＜0.01)。VEGF转染2 d后UCMSCs培养上清液中VEGF水平显著增加，并在转染后第4天达到顶峰，持续到第13天仍有较高水平表达。见表1。

图3 蛋白印迹法检测转染脐带间充质干细胞后3组VEGF、Akt表达

表1 ELISA检测3组转染UCMSCs后VEGF表达(±s)

表1 ELISA检测3组转染UCMSCs后VEGF表达(±s)

注:ELISA:酶联免疫吸附试验，VEGF:血管内皮生长因子，EGFP:增强型绿色荧光蛋白;VEGF-EGFP转染组、EGFP空载组加入VEGFEGFP和EGFP基因重组腺病毒液，对照组加入不含血清的DMEM培养基;与 EGFP空载组比较，b P＜0.01;与对照组比较，a P＜0.05，d P ＜0.01

培养时间(d)VEGF-EGFP转染组EGFP空载组 对照组2 2．03 ±0．06bd 0．24 ±0．02 0．29 ±0．02 0．26 ±0．03 0．25 ±0．04 4 2．46 ±0．02bd 1．05 ±0．04a 0．27 ±0．03 7 2．44 ±0．02bd 0．99 ±0．03a 0．32 ±0．08 10 2．42 ±0．03bd 0．47 ±0．02 0．41 ±0．12 13 2．23 ±0．03bd

2.3 CCK-8比色法检测转染对UCMSCs增殖的影响 在转染VEGF 24、48、96 h后CCK-8法检测结果显示，3组 UCMSCs比较差异均无统计学意义(P ＞0.05)，见表2。

3 讨论

对血液循环的重建而言，目前已知多种生长因子和细胞因子具有促进血管生成即血管化作用，其中VEGF被认为是机体内最强的促血管生长因子，研究证实VEGF可特异性地作用于血管内皮细胞，显著促进新生血管的形成，在动物实验及临床应用中显示了良好的效果［1］。但单纯VEGF作用下形成的血管仅由血管内皮细胞组成，其结构不够完整，通透性高，在局部形成不同程度的水肿，而新生血管的不稳定性也可能影响到该方法的远期疗效，因此，有必要对VEGF治疗血管生成进行更深入的研究。骨髓干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)具有多向分化潜能、容易在体外扩增和可自体移植的特性，移植BMSCs重建肢体血管的可行性和有效性近年来已得到大量实验及临床证实［2-5］，但采集BMSCs风险较大，对患者年龄、身体条件、心理接受程度要求较高。糖尿病患者干细胞移植后向血管内皮祖细胞分化能力下降，其增殖、黏附和参与血管形成能力都降低，机体不能为移植的细胞提供满意的增殖分化环境等问题，导致临床疗效降低，UCMSCs与BMSCs在生物学特性方面极为相似，而且来源更广泛，采集方便，扩增能力更强，免疫原性弱，具有更加有效的干细胞潜能，是治疗缺血性疾病更为良好的种子细胞和转基因载体细胞［6-8］。UCMSCs具有多向分化潜能，需要在适宜诱导因子作用下才能向血管内皮细胞分化，可作为基因治疗的受体细胞。为使诱导因子能持续高效发挥作用，利用分子组织工程学技术，将具有多重生物学效应及促血管新生最强因子VEGF基因转入UCMSCs，通过转基因干细胞在缺血局部持续表达高生物学活性的内源性VEGF以促进其向血管内皮分化，从而减少外源性诱导因子大剂量使用导致的不良反应，提高促血管新生及修复效果。

表2 CCK-8比色法检测转染对UCMSCs增殖的影响(±s)

表2 CCK-8比色法检测转染对UCMSCs增殖的影响(±s)

注:UCMSCs:脐带间充质干细胞，VEGF:血管内皮生长因子，EGFP:增强型绿色荧光蛋白;VEGF-EGFP转染组、EGFP空载组分别加入VEGF-EGFP和EGFP基因重组腺病毒液，对照组加入不含血清的DMEM培养基

培养时间(h)VEGF-EGFP转染组 EGFP 空载组 对照组24 0．47 ±0．02 0．42 ±0．02 0．45 ±0．04 48 0．66 ±0．03 0．70 ±0．03 0．64 ±0．12 96 1．37 ±0．06 1．13 ±0．08 1．46 ±0．05

基因治疗需要合适的载体，目前被研究应用最多的是腺病毒载体，有实验证实重组腺病毒Ad-VEGF165滴度高、毒性低、转染效率高、体外转染安全［9-10］。

本实验选择分泌型VEGF作为转入基因，携EGFP构建质粒，通过腺病毒感染UCMSCs后能够同时稳定表达EGFP和VEGF两种外源性基因，仍保持其原有分化特征，同时利用EGFP基因示踪可以充分了解融合基因的特征、理化特性及移植细胞在体内的功能和分泌，方便目的基因的表达鉴定及定位追踪［11］。本研究观察到用EGFP转染UCMSCs后在荧光显微镜下观察细胞在转染后的24 h即有EGFP的表达，48 h达到高峰，以后逐渐减弱，细胞形态结构无明显变化。流式细胞学检测发现MOI为400是较为合适的转染倍数，可以获得比较稳定的转染率，对细胞的形态和增殖没有影响，而且也不影响UCMSCs的血管分化能力［12］。CCK-8比色法检测VEGF-EGFP转染对UCMSCs增殖无影响。研究结果表明UCMSCs对于腺病毒是易感细胞［13］，VEGF165基因表达载体可有效转染UCMSCs，并在体外高效表达而不影响细胞生长，通过 Western blotting和ELISA检测显示，转染了VEGF基因的UCMSCs可以稳定表达外源性VEGF，转染2 d后培养上清液中已经开始有VEGF的产生，且显著高于对照组，到第4天时达到高峰，且能维持在一定水平的VEGF表达，至转染后第13天分泌的VEGF能够促进UCMSCs的增殖［14］。Akt在调节细胞存活和凋亡过程中起重要作用，激活Akt可以上调Bcl2和VEGF表达及促进细胞Akt磷酸化来抑制间质干细胞(MSCs)的凋亡作用，提高 MSCs的存活率［15-16］。本实验观察到过表达VEGF的UCMSCs中Akt呈现出更高的水平，而Akt作为抗凋亡蛋白之一，其高水平可明显提高UCMSCs的存活能力。本研究结果显示，转染VEGF基因的UCMSCs能使细胞获得局部持续、稳定、高效表达VEGF蛋白的能力，同时转染EGFP基因实现目的基因VEGF在体内外表达的示踪定位，了解转染后UCMSCs功能及分化、移植定位等;通过上调Akt信号通路等提高MSCs的抗凋亡能力，促进MSCs移植后的“归巢”及内皮修复。

总之，采用UCMSCs作为VEGF基因治疗的平台，通过有效目的基因转染入靶细胞，可持续高效表达高生物学活性的内源性VEGF以促进其向血管内皮分化，减少UCMSCs的凋亡，为VEGF基因联合UCMSCs治疗获得糖尿病下肢血液循环重建的可行性提供有力理论依据［17-21］。

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Transfection of Adenovirus-mediated Vascular Endothelial Grow th Factor into Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Vitro

LIXiao-ling1a，ZHU Lyu-yun1a，SONGGuang-yao2，XINGHan-ying2，LIU Su-rui1b，WANG Chao2(1．Bethune International Peace Hospital of PLA，a，Department of Endocrinology，b．Department of Blood Bank，Shijiazhuang 050082，China;2．Department of Endocrinology，People＇s Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China)

ObjectiveTo investigate the feasibility of transfection of adenovirus-mediated vector vascular endothelial growth factor(VEGF)into umbilical cordmesenchymal stem cells(UCMSCs)and the effectof VEGF transfection on UCMSCs function．MethodsVEGF165-EGFP genetic recombination of adenovirus vectors were constructed，and UCMSCs were isolated and cultured，and then adenovirus vector-enhanced green fluorescent protein(EGFP)transfected UCMSCs．The transfection effectwas observed under inverted fluorescencemicroscope，and transfection effectivenesswas detected by flow cytometer so to confirm the bestmultiplicity of infection(MOI)．Cells were divided into VEGF-EGFP transfection group，EGFP group and control group，and the cellswere transfected and collected based on the best MOI．Expressions of VEGF and protein kinase B(PKB also named Akt)signaling protein were detected by Western blotting;the expression of VEGF proteinwas detected by enzyme linked immunosorbentassay(ELISA)．The proliferation effectof transfected UCMSCswas evaluated with CCK 8 method．ResultsAdenovirus-mediated VEGF165-EGFP gene successfully transfected UCMSCs，and VEGF gene was transcribed and expressed in cells，and then was secreted out of cells．Levels of VEGF and Akt transfection secretion in VEGF-EGFP group 48 hours after transfection were significantly higher than those in EGFP group and control group;the expression and secretion of VEGF could be detected in VEGF-EGFP transfection group by ELISA 48 hours after transfection，and the peak appeared 4thd after transfection，at the same time the expressions in VEGF group were significantly higher than those in EGFP group and control group(P＜0.01)，and then the levels gradually decreased，butcanmaintain stable expression for severaldays．ResultsofCCK 8method showed that VEGF gene transfection had no significant effect on the UCMSCs proliferation．ConclusionAdenovirus-mediated VEGF-EGFP genemay successfully transfect UCMSCs，maintain UCMSCs original biological characteristics，and significantly and efficiently express VEGF，which can provide theoretical basis for the feasibility of VEGF gene combined with UCMSCs in treatment of diabetic lower limb blood circulation reconstruction．

Vascular endothelial growth factor;Umbilical cord mesenchymal stem cell;Adenovirus vector;Transfection

R349．8

A

2095-140X(2014)05-0005-05

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．05．002

河北省自然科学基金课题(H2013505067)

050082石家庄，解放军白求恩国际和平医院内分泌科(李晓玲、朱旅云)，输血科(刘素蕊);050000石家庄，河北省人民医院内分泌科(宋光耀、邢邯英、王超)

2014-02-20 修回时间:2014-03-16)

·论著·