刘建平，孔小燕

（1．河北联合大学基础医学院，河北 唐山063000；2．唐钢医院神经内科，河北 唐山063000）

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）目前已成为影响人类健康的常见病、多发病，其特征是病死率、致残率和复发率高，大大降低了患者的生活质量。大量研究证实IS后患者病情加重的主要原因与脑缺血再灌注损伤有直接关系。如何减轻脑缺血后神经细胞再灌注损伤是丞待解决的重要问题，而目前认为导致脑细胞损伤的关键环节是细胞内钙超载［1］。因体内Ca2＋依赖的多种激酶的功能受CAM的调节，所以CAM参与了体内多种疾病的生理病理过程。本文旨在研究卒中后CAM水平与脑梗死面积的关系，探讨是否可将IS后48小时CAM值作为最佳测量值，是否与急性期病情严重程度呈正相关，是否可作为一重要指标指导临床治疗。

1 对象和方法

1．1 研究对象 包括两部分，一部分为本院健康体检者，共100例，并排除心肝肾重大疾病及严重感染性疾病史。另一部分为2012年1月至2013年10月在唐钢医院住院的120例急性IS患者。所有患者均依照第四届全国脑血管病学术会议诊断标准经临床表现、CT 和（或）MRI确诊［4］。

1．2 实验方法

1．2．1 分组方法 将100例本院健康体检者设为正常对照组，其中男性52例，女性48例，平均年龄（61．2±9．4）岁。实验组为120例急性IS患者。其中男性66例，女性54例，平均年龄（62．6±11．6）岁。两组患者年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0．05）。其次，由两名神经科医师对入组的IS患者在卒中后48小时依据头颅CT计算脑梗死面积，按照Adamas分类法再将实验组的IS患者分为（三个亚组）大梗死组（脑梗死灶面积＞3cm2，并累及2个以上脑解剖部位的大血管主干供血区）27例；小梗死组（脑梗死面积在1．5～3．0cm2之间）42例及腔隙性脑梗死组（脑梗死面积＜1．5cm2）51例，三组患者年龄、性别比较差异，无统计学意义（P＞0．05）。

1．2．2 标本采集及处理 入选的急性IS患者在卒中后（2h、3h、6h、24h、48h、72h、6d、10d）采集静脉血测定血清钙调蛋白水平。对照组采清晨空腹静脉血。所有标本均使用生化真空促凝管采集，并在4℃冰箱中保存1d后离心，取血清1ml保存于－20℃冰箱中。

1．2．3 血清CAM检测 取出保存于－20℃冰箱中备用血清标本，置于室温融化，并平衡30分钟。CAM试剂盒购于上海艾莱萨生物科技有限公司。采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法（ELISA），应用美国EVOLIS全自动酶免分析仪进行测定。

1．3 统计学处理 采用SPSS 13．0统计学软件进行数据分析。计量资料正态分布变量以均数±标准差（±s）描述；分类资料用百分比描述。各组间比较：分类变量采用卡方检验，连续变量为正态分布两组间比较采用t检验。P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 CAM最佳测量值的确定 通过研究卒中后不同时段钙调蛋白水平变化后发现，CAM值在卒中后2～3小时开始上升，直至2～3天达高峰，在6天左右降至正常水平。说明卒中后48～72小时血清CAM浓度更能反映急性期病情轻重程度。故本研究所选用的CAM值均为IS后48小时的血清测定值。以下为卒中后不同时段CAM值变化趋势图，见图1。

图1 卒中后不同时段CAM值变化趋势图Fig．1 The trend chart of CAM values at different period after stroke

2．2 实验组与对照组CAM值比较 IS组患者血清CAM值均较正常对照组显著增高（P＜0．001），有统计学意义，见表1。

表1 两组患者血清CAM水平的比较（±s）Table 1 Comparison of two groups of serum calmodulin levels

表1 两组患者血清CAM水平的比较（±s）Table 1 Comparison of two groups of serum calmodulin levels

注：与对照组比较P＜0．001

组别n CAM（ng／ml）（images/BZ_21_1545_1514_1573_1567.png±s）t P对照组 100 88．98±23．41 15．34 ＜0．001实验组120 188．7±75．32

2．3 脑梗死面积组CAM值比较 三组患者血清CAM 水平比较有显著差异（F＝260．89，P＜0．001），有统计学意义。经Pearson相关分析发现三组IS患者血清CAM水平与梗死面积呈正相关关系（r＝0．616，P＜0．05），见表2。

表2 实验组中三个亚组患者血清CAM测定值比较Table 2 Comparison of serum calmodulin levels

3 讨论

急性缺血性卒中是目前发病率、致残率及复发率极高的疾病。脑缺血再灌注损伤的发生机制十分复杂，而目前认为导致脑细胞损伤的关键环节是细胞内钙超载［1］。CAM 是细胞内功能最重要的钙受体蛋白，在缺血性脑卒中再灌注损伤时不但对神经细胞内钙超载起着关键的调控作用，而且对大量自由基生成、NO释放、兴奋性氨基酸等神经递质的释放、凋亡基因的激活等有直接或间接影响［3］。CaM是目前研究得功能最重要的一种Ca2＋结合蛋白，体内Ca2＋依赖的多种激酶的功能受钙调蛋白调节，因其参与了体内多种疾病的生理病理过程［4～6］。最近Swarnkar S通过研究发现，鱼藤酮通过增加细胞内的钙超载及CAMKII酶的活性诱导了神经细胞的凋亡［10］。Chen S［11］等人通过对 Na＋－Ca2＋交换器的研究进一步证实了Ca2＋超载对心肌损伤的机制。近年来大量的动物实验证实了CaM信号系统在脑损伤中起关键性作用。CaM可调控包括G1u、天门冬氨酸等兴奋性氨基酸的释放，尤其在脑缺血、缺氧后作用明显［9～11］。有研究表明血清兴奋性氨基酸水平与新生儿缺氧缺血性脑病的发生呈正相关［12］。通过培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞，Di Pietro等人研究发现，CaM直接参与NOS合成NO，高浓度的Ca2＋与CaM结合后激活CaMKⅡ从而增加iNOS的表达，导致糖尿病大鼠血管的损伤［13］。大量动物实验证实，缺血再灌注后脑组织中的CaM水平随着细胞内Ca2＋超载增加呈明显上升趋势［14］。综上所述，我们可以看出目前大多数CAM方面的研究主要以IS的动物实验模型为研究对象，而对于CAM与卒中严重程度的研究却非常少。仅有一例临床研究表明血清CaM值与急性IS有明显相关性［15］。该研究发现急性IS后患者血清CAM水平明显高与健康对照组，血清CAM水平与NIHSS评分呈正相关性。虽然这一研究已经肯定了CAM在卒中后病情严重程度的指导价值，但卒中发病后具体哪个时间段的CAM值最能反应脑卒中的严重程度，上述研究未进一步阐明。本文通过对卒中后48小时血清CaM值的进一步研究，探讨CaM这一指标对脑血管病轻重程度的指导价值。在体内由于血清CAM水平的检测具有快速、稳定等优点，故可将其作为评估病情严重程度的重要生物学指标。

本研究通过对CAM数值的观察发现，卒中后48～72小时血清CAM浓度更能反映急性期病情的严重程度。依据入院12小时内以及6天后测量的CAM值对病情的评价作用是很小的。本研究表明急性脑缺血将引起早期的细胞内钙超载，进而引发一些列由钙信号系统介导的级联反应。但这种级联反应通常需要2小时左右的时间启动。虽然启动时间短暂，而由此引发的生物学效应却可持续数天之久，激活其下游靶酶及有关转录调节因子，引起神经元损伤／抗损伤平衡的失调，导致细胞死亡。因此可以推断卒中后级联反应的强度与急性期病情的轻重是相关密切的，而这种反应的强弱将直接体现在患者脑组织损害的严重程度。因此，对血清CAM最佳测量时间段的确定是非常关键的因素，故本研究以卒中后48小时血清CaM值为研究指标。研究发现急性IS后患者血清CAM值明显高于健康对照组，这一结论与以往的研究结果是一致的。大梗死组、小梗死组、腔隙性脑梗死组三组患者血清CAM值比较有显著差异（F＝260．89，P ＜0．001），有 统 计 学 意 义。 进 一 步 经Pearson相关分析发现三组IS患者血清CAM水平与梗死面积呈正相关关系（r＝0．616，P＜0．05）。说明IS患者脑梗死面积越大，血清CAM水平就越高。

研究认为CAM水平的变化与患者脑损伤后钙超载有关。进一步推测钙超载会引起钙调蛋白的过度表达，正是这种钙调蛋白与离子过度的结合才导致卒中后脑损伤的发生。曾有人就多种钙通道阻滞剂如三氟拉嗪、联苯苄唑作了相关研究发现，其作用是通过抑制神经元细胞的Ca2＋内流而影响CaM的活性，进而抑制神经递质的释放、保护脑组织［16，17］。最近研究发现脑源性神经营养因子在脑梗死时合成增加，其神经保护机制可能与抑制钙蛋白酶活性进而抑制Ca2＋的内流，防止脑内Ca2＋过度蓄积，进而起到了脑保护作用［18］。Tang LH［19］研究发现，磷酸肌酸是通过减少Ca2＋的内流进而减少自由基的产生，减少了脑细胞坏死。据Cheng等人研究发现电针可能是通过降低脑缺血再灌注大鼠脑神经元的CAM水平、抑制其下游信号转导，减轻了脑细胞损伤［20］。因此抑制钙调蛋白的功能可能是卒中治疗的一个关键环节。

4 启示与结论

目前，在缺血性脑卒中的治疗中，尚未把CAM检测作为评估缺血性事件轻重程度的常规指标，还未确定CAM相应的危险分层标准，本文研究结果提示，卒中后48小时血清钙调蛋白水平可作为一重要指标评价急性缺血性脑卒中患者病情的严重程度。

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