王娟，余锐，黄惠华

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州，510641）

茶树花是茶树（Camellia sinensis）开出的花朵，含有丰富的蛋白质、茶多糖、氨基酸、维生素等多种有益成分和活性物质，对人体具有解毒、降脂、降糖、抗癌、滋补、养颜等功效[1-2]。利用超临界CO2萃取所得的茶树花浸膏，使茶树花中部分茶多酚、茶多糖、咖啡因和黄酮类等活性物质残留在萃取后的茶树花渣中[3-4]，从而使茶树花渣有一定的生理活性，目前已有研究表明茶叶具有降血脂和抗氧化的功效[5], 但对茶树花的相关功效研究室鲜有报道，因此，本文研究茶树花的超临界萃取物以及茶树花渣萃取物的降血脂及抗氧化活性，为茶叶种植的副产物——茶树花的综合利用提供参考。

本文通过测定茶树花浸膏和茶树花渣乙醇萃取物与胆酸盐的结合能力来初步研究其降血脂能力；通过比较茶树花浸膏、茶树花渣乙醇萃取物与传统抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）对DPPH自由基（DPPH·）、超氧阴离子（O·）和羟自由基（·OH）的清除能力来研究其抗氧化能力。

1.材料与方法

1.1 材料与仪器

干茶树花，英红1号，广东省农业科学院茶叶研究所茶园；牛磺胆酸钠(STC) 美国Sigma公司；甘氨胆酸钠(SGC)日本TCI公司；BHT 上海国药集团化学试剂有限公司；DPPH 美国Johnson Matthey公司。

UV-1800 紫外/可见分光光度计日本岛津公司；HL-（1L+5L）/50MPa-IIB型超临界萃取装置 杭州华黎泵业有限公司。

1.2 茶树花萃取物的制备

1.2.1 茶树花浸膏 将干茶树花粉碎过筛后放入萃取釜中进行超临界CO2萃取得茶树花浸膏，具体工艺参数为：压力35MPa，温度：48℃，夹带剂95%乙醇添加量(w/w)：43%，萃取时间120min[4]。

1.2.2 茶树花渣乙醇萃取物 将经超临界CO2萃取后的茶树花渣烘干粉碎过10目筛，称取一定量于三口烧瓶中，加入95%乙醇，于80℃下搅拌回流萃取2h，萃取两次，第二次的萃取时间为1h。合并两次的萃取液，4℃冷藏24h，趁冷过滤除杂，50℃真空浓缩至近干后真空干燥，得到茶树花渣乙醇萃取物。

1.2.3 试验样品溶液的配制 将茶树花浸膏和茶树花渣乙醇萃取物分别溶于无水乙醇中，分别依次配制成32、 16、8、4、2、1mg/m L的梯度溶液。

1.3 降血脂实验

肝脏中胆汁酸主要以与盐结合的形式存在，并主要与甘氨酸和牛磺胆酸结合形成甘氨酸胆酸钠（SGC）或牛磺胆酸钠（STC），因此可通过测定样品对胆酸盐的吸附能力来表征其降血脂能力[5-6]。

分别移取待测样品的不同浓度溶液各1mL于10m L具塞试管中，加入4m L胆酸盐溶液（STC、SGC的0.3mmol/L，pH6.3的0.1mol/L磷酸缓冲液配制），在37℃分别恒温振荡1h，混合物转入离心管，4000r/min离心20min，取上清液2.5m L于10m L具塞试管中，再加入7.5mL质量分数为60%的硫酸溶液，于70℃水浴20min,取出冰浴5min，在387nm处测定吸光度，样品对胆酸盐的吸附率按以下公式计算：

式中：A0-4m L胆酸盐的磷酸缓冲溶液＋1m L无水乙醇的吸光度；A1-4mL胆酸盐的磷酸缓冲溶液＋1m L样品乙醇溶液的吸光度；A2-4m L磷酸缓冲溶液＋1m L样品乙醇溶液的吸光度。

1.4 抗氧化实验

1.4.1 清除DPPH·的实验方法 试管内加入2.5m L、6.5×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，然后加入0.5m L待测样品溶液，摇匀，室温下避光放置20min后测定混合溶液在517nm处的吸光度，清除率按以下公式计算[3]：

式中：A0为2.5mL DPPH溶液＋0.5m L无水乙醇的吸光度；A1为DPPH溶液2.5m L＋0.5m L样品溶液的吸光度；A2为2.5m L无水乙醇＋0.5m L样品溶液的吸光度。

式中：A0为0.2m L邻苯三酚盐酸溶液+0.3m L无水乙醇+2.5m LTris-HCl缓冲溶液的吸光值；A1为0.2mL邻苯三酚盐酸溶液+0.3m L样品乙醇溶液+2.5m LTris-HCl缓冲溶液的吸光值；A2为0.2mL盐酸溶液+0.3m L样品乙醇溶液+2.5m LTris-HCl缓冲溶液的吸光值。

1.4.3 邻二氮菲-Fe2+清除·OH的实验方法 取 1m L、5mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入2m L、pH7.4的0.2mol/L磷酸缓冲溶液和1m L样品溶液的溶剂，充分混匀后，加入1m L、5mmol/L硫酸亚铁溶液(FeSO4)，混匀后，加入1m L、0.1%双氧水(H2O2)，于37℃水浴60min后，在536nm测其吸光值，即损伤管的吸光值A1。未损伤管以1m L蒸馏水代替损伤管中1m l 0.1%的双氧水，样品管以1m L样品溶液代替损伤管中的1m L样液的溶剂，其他同损伤管，测得未损伤管的吸光值A0及样品管的吸光值A2，清除率按以下公式计算[3]：

2.结果与分析

2.1 样品吸附胆酸盐实验

表1 样品对两种胆酸盐的吸附率Table1 Adsorption rate of Samples to two bile salts

表2 样品浓度与胆酸盐吸附率的方程拟合Table2 Fitting equation for sample concentration and adsorption rate of bile salts

从吸附胆酸盐的类型来看（表1），在浓度为1～2mg/m L的范围，茶树花浸膏结合SGC的能力都强于结合STC；茶树花渣乙醇萃取物在浓度为1mg/m L时，结合SGC的能力强于结合STC。在2mg/m L的以上浓度，两种样品吸附STC的能力强于吸附SGC。在茶树花浸膏浓度达到8mg/m L时，对两种胆酸盐的吸附率明显升高，这表明样品对胆酸盐的吸附率可能与样品中所含有的具有吸附活性的成分的浓度有关。

由表2可见，在1～32mg/m L的浓度范围，茶树花浸膏对胆酸盐的吸附率与其浓度方程拟合度较高，通过样品浓度为5mg/m L时的吸附率Y5比较，茶树花浸膏对STC和SGC两种胆酸盐的吸附能力差异不大。茶树花渣乙醇萃取物在2～32mg/m L的浓度范围，其浓度与胆酸盐的吸附率拟合度较高，而且其对STC的吸附能力强于对SGC的吸附。此外，通过吸附率Y5的比较可以看出，茶树花渣乙醇萃取物对两种胆酸盐的吸附能力与考来烯胺的更加接近，而茶树花浸膏对两种胆酸盐的吸附能力较差。

2.2 样品抗氧化性能

2.2.1 清除DPPH自由基能力

图1 茶树花浸膏、茶树花渣乙醇萃取物和BHT清除DPPH·比较Fig.1 DPPH· scavenging rate of tea flower extract, ethanol extracts from tea flower residue and BHT

表3 样品浓度与DPPH·清除率的拟合方程Table3 Fitting equation of sample concentration and DPPH· scavenging rate

从图1和表3可以看出，两种样品和对比物BHT随着浓度的增加对DPPH·的清除率也随之增加，其中BHT的清除率增加不明显，在浓度为1～8mg/m L的范围，BHT对DPPH·的清除率就达到了80%，茶树花渣乙醇萃取物在浓度为8mg/m L时，对DPPH·的清除率也达到了80%，随着浓度的增加，茶树花浸膏对DPPH·的清除率从3.21%增加到72.43%，两种样品和对比物BHT对DPPH·的清除率从大到小的顺序依次为BHT＞茶树花渣乙醇萃取物＞茶树花浸膏，这在拟合方程的IC50中也得到了验证，以IC50值衡量，茶树花渣乙醇萃取物对DPPH·清除能力为茶树花浸膏的52.2倍。

图2 茶树花浸膏、茶树花渣乙醇萃取物和BHT清除O·比较Fig.2 O· scavenging activities of tea flower extract, ethanol extract from tea flower residue and BHT

表4 样品浓度与O·清除率的拟合方程Table4 Fitting equation of sample concentration and O· scavenging rate

表4 样品浓度与O·清除率的拟合方程Table4 Fitting equation of sample concentration and O· scavenging rate

样品 样品浓度-清除率的拟合方程 R2 IC50(mg/m L)茶树花浸膏 y= 19.277ln(x)- 5.810 0.9654 18.084茶树花渣乙醇萃取物 y= 14.575ln(x) +34.671 0.9524 2.863 BHT y= 13.631ln(x) +27.949 0.9781 5.043

从图2和表4可以看出，两种样品和对比物BHT随着浓度的增加对O·的清除率也随之增加，在浓度为1～16mg/m L的范围，两种样品和对比物BHT对O·的清除率增加幅度较大，在浓度大于16mg/m L的范围，茶树花渣乙醇萃取物和BHT对O·的清除率几乎没有增加，而茶树花浸膏对O·的清除率在此范围从50.51%增加到62.42%，有较大增加。两种样品和对比物BHT对O·的清除率从大到小的顺序依次为茶树花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶树花浸膏，这在拟合方程的IC50中也得到了验证，以IC50值衡量，茶树花浸膏对O·清除能力是BHT的27.8%，而茶树花渣乙醇萃取物对O·清除能力为BHT的1.76倍。

2.2.3 邻二氮菲-Fe2+清除·OH

图3 茶树花浸膏、茶树花渣乙醇萃取物和BHT清除·OH比较Fig.3 ·OH scavenging activities of tea flower extract, ethanol extract from tea flower residue and BHT

表5 样品浓度与·OH清除率的拟合方程Table5 Fitting equation of sample concentration and ·OH scavenging rate

茶树花渣乙醇萃取物 y= 14.492ln(x) +40.147 0.9743 1.974 BHT y= 15.569ln(x) +30.091 0.9864 3.593

从图3和表5可以看出，两种样品和对比物BHT随着浓度的增加对·OH的清除率也随之增加，在浓度为1～16mg/m L的范围，两种样品和对比物BHT对·OH的清除率增加幅度较大，在浓度大于16mg/m L的范围，茶树花渣乙醇萃取物和BHT对·OH的清除率几乎没有增加，而茶树花浸膏对·OH的清除率在此范围从59.53%增加到70.43%，有较大增加。两种样品和对比物BHT对·OH的清除率从大到小的顺序依次为茶树花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶树花浸膏，这在拟合方程的IC50中也得到了验证，以茶树花浸膏的IC50值衡量，茶树花浸膏对·OH清除能力为BHT的28.5%，而茶树花渣乙醇萃取物对·OH清除能力为BHT的1.82倍。

3.结论

（1）吸附胆酸盐实验结果表明：茶树花渣乙醇萃取物对胆酸盐的吸附能力强于茶树花浸膏，尤其在浓度为 1～8mg/m L的范围。茶树花渣乙醇萃取物对两种胆酸盐的吸附能力更接近于考来烯胺对两种胆酸盐的吸附能力。茶树花浸膏对胆酸盐的吸附能力较弱，但在浓度大于 8mg/m L时，茶树花浸膏对胆酸盐的吸附能力大大增强。这可能是由于不同极性溶剂和萃取方法所得样品的组分有所差异，组分中茶多酚和咖啡碱含量的差异可能对样品的降血脂能力有影响。

（2）抗氧化实验结果表明：三种样品对DPPH·的清除率从大到小的顺序为：BHT＞茶树花渣乙醇萃取物＞茶树花浸膏。对O·和·OH的清除率能力排序为：茶树花渣乙醇萃取物＞BHT＞茶树花浸膏。根据样品浓度与自由基清除率的拟合方程，以IC50值衡量，茶树花渣乙醇萃取物对DPPH·清除能力约为茶树花浸膏的52.2倍；茶树花浸膏对O·清除能力为BHT的27.8%，而茶树花渣乙醇萃取物对O·清除能力为BHT的176.1%，茶树花浸膏对·OH清除能力为BHT的28.5%，而茶树花渣乙醇萃取物对·OH清除能力为BHT的182.0%。这可能是由于两种样品的组分差异使其对DPPH·、O和·OH的清除能力有显著差异。

[1] 顾亚萍, 钱和.茶树花香气成分研究及其香精的制备[J].食品研究与开发, 2008, 29(1): 187-190

[2] 余锐,王娟,黄惠华.响应曲面法优化微波辅助萃取制备茶树花浸膏的工艺研究[J].现代食品科技，2011,27(11):1375-1378转1315

[3] 余锐.茶树花的超临界CO2萃取及其浸膏的功能性研究[D].广州: 华南理工大学, 2012

[4] 余锐,王娟,黄惠华.响应曲面法优化超临界 CO2萃取茶树花工艺及萃取物成分分析[J].食品科学, 2012,33(12):102-107.

[5] 胡凯.茶叶功能性成分体外降血脂的机理研究[D].广州: 华南理工大学, 2011

[6] 胡凯,黄惠华.不同茶浸提液对胆酸盐的结合及其降血脂机理的研究[J].食品工业科技, 2011,32(8):105-107,111.