王飞，农云军，窦文渊，石燕丽（中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）

含乳饮料中甜蜜素的测定及提取方法的改进

王飞，农云军，窦文渊，石燕丽
（中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）

对气相色谱法测定含乳饮料中甜蜜素含量的方法进行优化和改进，先用蛋白酶去除含乳饮料中的蛋白，使其变成澄清的溶液再按国标方法提取衍生。在优化的色谱条件下，甜蜜素的分离度高，线性范围为0.10～1.00 mg/mL，相关系数r=0.999 9，定量限为0.005 g/kg，相对标准偏差＜5.0%，回收率为96.7%～99.3%。结果表明，该方法前处理简单方便，分析时间较短，精密度及准确度高。

含乳饮料；甜蜜素；提取方法；改进

甜蜜素的化学名称为环己基氨基磺酸钠，是一种无营养、甜度高的人工合成甜味剂。人体过量摄入会产生致癌、致畸、损害肾功能等副作用[1-2]，所以许多国家禁止使用或是限制使用甜蜜素作为食品添加剂，我国在GB2760—2011《食品添加剂使用卫生标准》中规定其在饮料中最大使用量为0.65 g/kg。甜蜜素的测定方法主要有气相色谱法、气质联用法、液相色谱法、液质联用法、离子色谱法、比色法、薄层色谱法等[3-13]。目前最常用的是GB/T5009.97—2003《食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中推荐的气相色谱法[13]，因为其快速、简便、灵敏度高而一直为业界所推崇。但是由于标准出台时间比较早，受到实验条件和社会大环境的影响，制定标准时在技术上受到一定的限制。

依国标GB/T 5009.97—2003《食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中规定的方法，目前对含乳饮料采用液体试样的前处理方式，对于不同种类的液体样品没有详细规定。但是，在实际的操作过程中，由于含乳饮料不是澄清的液体，存在着严重的沉淀和乳化现象，两相之间分层不明显，导致加标回收率低，影响了测定的准确性。因此，本实验对含乳饮料的前处理方法进行了细节改进，优化了色谱条件，使其前处理方法简单，得到甜蜜素的分离色谱峰峰形好，方法回收率高、相对标准偏差及检出限令人满意。此方法准确、稳定、快速，有很高的推广实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

含乳饮料：市售；环己基氨基磺酸钠对照品：美国Sigma公司；液体蛋白酶（酶活力16 000 U）：诺维信（中国）投资有限公司；正己烷、氯化钠、亚硝酸钠、浓硫酸均为分析纯：广州试剂厂；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A带火焰离子检测器（flame ionization detector，FID）检测器和7693自动进样器、Agilent Chemstation色谱工作站：美国安捷伦公司；BSA124S-CW电子天平：德国赛多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

1.3.2 标准溶液的配制

准确称取1.000 g环己基氨基磺酸钠对照品，用蒸馏水溶解定容于100 mL容量瓶中，得质量浓度为10.0 mg/mL的标准溶液。吸取10.0mg/mL甜蜜素标准液0.10mL、0.20mL、0.40 mL、0.80 mL、1.00 mL分别于100 mL具塞比色管中，加水至10 mL，相当于甜蜜素的质量浓度为0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL，置于冰浴中，充分冷却后，加入50 g/L亚硝酸钠溶液5 mL，100 g/L硫酸溶液5 mL，摇匀，在冰浴中放置30 min，经常摇动，取出，准确加入10.0 mL正己烷和5.0 g氯化钠，密塞，手动振摇80次，静置分层，吸出正己烷层，超滤后装进样瓶待测。

1.3.3 样品处理

精密称取含乳饮料样品20.0 g，加入5 mL液体蛋白酶去除蛋白，室温条件下放置10 min，离心取清液于100 mL比色管中，置冰浴中。按照国标GB/T5009.97—2003《食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中规定的方法，加入50 g/L亚硝酸钠溶液5mL，100g/L硫酸5mL，摇匀，在冰浴中反应30 min，并经常摇动，然后准确加入10.0 mL正己烷，5 g氯化钠，振摇80次，待分层后吸出正己烷层用0.45 μm微孔滤膜过滤，上机检测。

2 结果与讨论

2.1 对国标方法的改进

2.1.1 试样制备方法的改进

国标方法中对于液体样品的试样制备是摇匀后直接取样20.0g置于比色管中，冰浴后加入相应的衍生试剂反应30 min，再进行萃取。但是含乳饮料样品本身是一种乳白色的悬浊液，含有大量的蛋白质，如果不进行任何预处理就直接加入亚硝酸钠和硫酸溶液衍生，含乳饮料中的蛋白质在酸性条件下会发生变性而沉淀，大大影响了衍生效果，衍生效率只有40%～50%。因此，必须要先对含乳饮料进行预处理得到澄清的液体再加入衍生剂和萃取剂才能得到良好的实验结果。本研究通过反复实验，在国标方法的基础上增加一步，先去除含乳饮料中的大量蛋白质，回收率会大大提高，即采取先向样品中加入5mL液体蛋白酶，摇匀，室温放置10 min，离心得到澄清的样品溶液，再按照国标方法进行提取衍生。此去除蛋白的方法比文献[14-15]报道的更简单易行。如果萃取过程发生乳化现象，可以根据样品的差异采取离心的方式或是加入少许乙醇进行消泡，有助于迅速分层。

2.1.2 样品的保存时间的研究

众所周知，通常衍生物的稳定性较差，但是国标方法中未提及样品衍生后的保存及稳定性问题。将处理好的样品溶液放置在4℃冰箱中冷藏，间隔一定时间（0、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）测定其峰面积，发现甜蜜素衍生产物-环己醇亚硝酸酯随着时间的推移峰面积会变小，放置3 h后已减小了4.3%，5 h后已衰减了10%，这说明甜蜜素衍生物会随着时间的延长而慢慢分解，质谱[5]证明其分解后生成了环己醇。由此可见，样品提取完成后应在5 h内完成测定，如果是大批量样品要把握好样品的处理和上机测定时间，这样才能保证样品的稳定性及准确性。

2.1.3 色谱条件的选择和优化

国标中采用的色谱条件为80℃恒温，采用10%SE-30不锈钢填充柱测定。目前石英毛细管柱较为普及，且分离效果较好，因此采用石英毛细管柱，分别比较了HP-1、RtxR-5、HP-innwax、FFAP等色谱柱，实验表明，RtxR-5柱的分离效果最好。为了避免较低温度的恒温操作会有残留物干扰下次测定，采用60℃起温，保持1 min，以15℃/min的速率升至150℃，保持3 min的程序升温方法，甜蜜素的峰形和分离度更好，杂质干扰小，保留时间适中，并且减少样品中一些沸点较高的未知组分在色谱柱内的残留，适用于定量分析，结果见图1。

图1 甜蜜素对照品(A)和样品中甜蜜素(B)的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of sodium cyclamate standard(A)and sample solution(B)

2.2 线性范围和定量限

取不同质量浓度的对照品溶液，在选定的色谱条件下测定，质量浓度在0.10～1.00 mg/mL范围内与峰面积线性良好，相关系数r为0.999 9。甜蜜素的定量限（S/N=10）为0.005g/kg。本方法的定量下限远远低于实际样品的添加量。

2.3 精密度实验

用0.40 mg/mL的甜蜜素对照品溶液，进样1.0 μL，重复6次，结果如表1所示，保留时间和峰面积的相对标准偏差（relativestandarddeviation，RSD）分别为0.008%和1.05%，说明该方法精密度较好。

表1 精密度实验结果(n=6)Table 1 Results of precision tests(n=6)

2.4 平行性实验

按照“1.3.3”方法处理方法，取某品牌乳酸饮料样品均匀取样6份，按照上述色谱测定条件对其中的甜蜜素含量进行测定，结果如表2所示，RSD为2.75%，说明该方法具有良好的重复性，稳定可靠，能满足检测要求。

表2 平行性实验结果Table 2 Results of parallel experiment

2.5 加标回收率实验

取适量某品牌乳酸饮料样品，在最佳的实验条件下，按照“1.3.3”方法处理样品，同时按加入约本底平均值50%～150%的对照品进行加标回收率实验，结果如表3所示。

表3 回收率测定结果(n=5)Table 3 Results of recovery experiment(n=5)

由表3可知，加标回收率为96.7%～99.3%，RSD为1.10%～1.67%，说明该实验准确度较好。

3 结论

对含乳饮料中甜蜜素含量的测定方法进行了细节性改进，在前处理时先加入蛋白酶去除蛋白，使其变成澄清的溶液再进行提取衍生，验证了样品的稳定性时间为5 h，采用RtxR-5毛细管柱程序升温检测甜蜜素，其线性范围为0.10～1.00 mg/mL，相关系数r=0.999 9，RSD＜5.0%，回收率为96.7%～99.3%，方法的定量限为0.005 g/kg。结果表明该方法前处理简单方便，分析时间较短，灵敏度高，用于实际样品的测定，结果令人满意，该方法对乳饮料中其他添加剂的检测有借鉴作用，为从事食品安全检测人员提供了一定的参考信息，在保障食品安全方面有着重要的实际意义。

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Determination of sodium cyclamate in milk beverage and extraction method improvement

WANG Fei,NONG Yunjun,DOU Wenyuan,SHI Yanli

(Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangzhou 510070,China)

A method for sodium cyclamate content determination in milk beverage by gas chromatography was optimized.The protein in the milk beverage was removed by protease,and derived according to National Standard method.On conditions of optimized gas chromatography,the separating degree of sodium cyclamate was better,the linear detection range was 0.10-1.00 mg/ml(r=0.999 9)and the limit of quantity was 0.005 g/kg.The recovery rate and precision were in the range of 96.7%-99.3%and relative standard deviation(RSD)was less than 5.0%.Results indicated this method has simple pretreatment,shorter analysis time with high precision and accuracy.

milk beverage;sodium cyclamate;extraction method;improvement

O657.7

A

0254-5071（2014）07-0095-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.021

2014-05-04

广东省自然科学基金资助项目（7300055）；中国广州分析测试中心自筹资金科研项目（20100008）

王飞（1979-），女，副研究员，博士，研究方向为食品与环境分析检测。