肖君，甄玉国，2*，王晓磊（.吉林农业大学动物科学技术学院吉农博瑞奶牛研发中心，吉林长春308；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春304）

米曲霉不同培养方式的发酵探究

肖君1，甄玉国1，2*，王晓磊1
（1.吉林农业大学动物科学技术学院吉农博瑞奶牛研发中心，吉林长春130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春130114）

利用10 L发酵罐在摇瓶实验基础上进行了米曲霉（Aspergillus oryzae）放大实验。根据不同菌体形态对代谢产物的影响，在米曲霉菌丝生长到絮状前，终止发酵。指数补料实验结果表明，分批发酵在第14小时菌体干质量达到最大值15.06 g/L，比摇瓶发酵提高了33%；指数补料在第16小时菌体干质量达到20.43 g/L，比分批发酵提高26%。

米曲霉；发酵罐；指数补料

米曲霉（Aspergillus oryzae）是一种好气性真菌，分类学归属于半知菌亚门、曲霉属。米曲霉为典型的丝状真菌，菌丝一般呈黄绿色，酸度较大的培养基上呈绿色，酸度较小的培养基上呈黄色，老化后逐渐为褐色[1]。丝状真菌在工业化生产中应用十分广泛，其在发酵过程中一般存在球状、絮状、团块状3种形态，不同代谢产物所适宜的形态不同，在不同形态下，代谢产物的积累差异明显，团块状的菌体形态在发酵过程中接种量难于控制，且极大地限制了菌体内部的传氧、传质，产物产量明显偏低，一般不选用[2]；絮状菌体营养物质和氧气在其内部传输较为顺利，但其能增加发酵液黏度，形成假塑型流体，降低物质、氧气在发酵液中的传递效率，同时还极易缠绕搅拌桨，使发酵产物产量、发酵罐性能降低。

甘蔗糖蜜是甘蔗制糖的副产品，含有大量的蔗糖，总糖约40%～60%，同时含有大量的有机和无机胶体物质、盐类及泥沙等，是一笔巨大而可观的可发酵性资源[3]。

发酵罐深层发酵是与摇瓶发酵不同的培养方式，在摇瓶培养中得到的菌丝体及其次级代谢产物含量，一旦放大到发酵罐中情况就有所不同[4]。

为建立米曲霉液体培养生物量最大的技术，以糖蜜为底物，发酵时间控制在菌体对数期末期，形态为液体，为工业化生产米曲霉代谢物组的生物制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米曲霉（Aspergillus oryzae）：吉农博瑞奶牛研发中心实验室分离。

斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[5]：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，自来水1 000 mL，自然pH值。

发酵培养基：尿素0.4%，蛋白胨0.3%，磷酸氢二钾0.16%，硫酸镁0.07%，氯化钠0.05%，硫酸铁0.05%。

葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠、蒽酮等均为分析纯：北京化工有限公司。

1.2 仪器与设备

BLBIO-10L发酵罐：上海百伦生物科技有限公司；GI80T全自动立式高压灭菌锅：厦门致微仪器有限公司；GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；PHS-2C型数显酸度计：上海SANXIN公司；HZP-150型恒温振荡培养箱：上海精宏实验设备有限公司；SPX-150型生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；岛津UV-1201分光光度计：日本岛津公司；SW-CJ-IF型洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 米曲霉菌种孢子悬浮液制备

（1）用生理盐水将平板上的孢子（培养72 h）洗脱，放入装有灭过菌的玻璃搅拌珠（起打散作用）的三角瓶中之后磁力搅拌器，200 r/min的振荡20 min。

（2）无菌操作台5层无菌纱布过滤培养液以除去培养液中的菌丝体，调节孢子浓度为1×106CFU/mL，4℃保存备用[6]。

1.3.2 生长曲线的测定

在10L发酵罐中装液量为6L，转速设定为100r/min，通气量最大为60L/h，温度37℃，接种量为8%的5×106CFU/mL孢子悬浮液，pH值采用自动流加2 mol/L的NaOH控制在6.0，发酵周期为18 h，每2 h取样1次，分别测定米曲霉的生物量和残糖的含量。以培养时间为横坐标，生物量、残糖为纵坐标绘制分批发酵的代谢曲线。

1.3.3 分批发酵

发酵罐参数：在10 L发酵罐中装液量为6 L，转速设定为100 r/min，通气量最大为60 L/h，温度37℃，接种量为8%的5×106CFU/mL孢子悬浮液，pH值控制在6.0，采用自动流加2 mol/L的NaOH，发酵周期为18 h，每2 h取样1次，测定米曲霉的生物量和残糖的含量。以培养时间为横坐标，生物量、残糖为纵坐标绘制分批发酵的代谢曲线。

1.3.4 指数补料

发酵罐参数：在10 L发酵罐中装液量为6 L，转速设定为100 r/min，通气量最大为60 L/h，温度37℃，接种量为8%的5×106CFU/mL孢子悬浮液，pH值控制在6.0，采用自动流加2 mol/L的NaOH，在发酵的第11小时开始指数补加糖蜜F=67 mL/h，每2 h取样一次，分别测定米曲霉的生物量和残糖的含量。发酵培养基的初始糖的质量浓度为60 g/L。补加糖蜜的糖质量浓度为400 g/L。糖蜜采用流加方式补入发酵罐，以提前设定的速度指数流加。流加速度用罐体的蠕动泵来控制，流加速度计算公式：

式中：F表示流加速度，L/h；v是初始体积，L；X0代表细胞浓度，g/L；u是比生长速率，h-1；t是时间，h；S0是糖补料液的质量浓度，g/L；Yx/s是糖对细胞产率系数；exp是指数函数[7]。

1.3.5 菌体干质量的考察

将发酵液进行真空抽滤，蒸馏水洗涤3次，滤纸连同菌体置于烘箱中105℃烘干至质量恒定。精确称量菌体干质量，以其来衡量米曲霉的生物量[8-9]。

1.3.6 糖含量的测定与标准曲线绘制

糖含量的测定采用蒽酮比色法。精确称取干燥后的葡萄糖0.5 g加蒸馏水溶解，定容至50 mL，制成质量浓度10 g/L的葡萄糖溶液。

标准曲线绘制：取6支试管，分别吸取质量浓度为10g/L的葡萄糖溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置于10 mL试管中，在每支试管中立即加入蒽酮试剂5.0 mL，摇匀后煮沸10 min取出，冷却至室温。在波长620 nm处，以第一管为空白，测其余各管吸光度值。以标准葡萄糖含量x（μg/mL）为横坐标，以吸光度值y为纵坐标，制作葡萄糖标准曲线。

1.3.7 样品中糖含量的测定

取两支试管加样1 mL（0.2 mL样+0.8 mL蒸馏水），加蒽酮5 mL，摇匀后沸水浴中10 min，冷却后于波长620 nm处测定吸光度值[10]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

用紫外分光光度计在波长490 nm处测定葡萄糖标准溶液的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，标准曲线线性回归方程：y=0.006 8x+ 0.0079，相关系数R2=0.999，在1～100μg/mL线性关系良好。

2.2 米曲霉生长曲线的测定

测定生长曲线的实验条件如1.3.2。图2为米曲霉的生长曲线，培养时间为26 h，生物量达到12.99 g/L。在对数期末期时，菌体大量繁殖使得发酵液黏稠。由于发酵液黏稠就很难使其混合均匀，至使营养物质、溶解氧、pH值、CO2、温度等在发酵罐中出现差异[11]。所以本研究发酵终止在菌体生长的对数期末期。

图2 米曲霉生长曲线Fig.2 Growth curve ofA.oryzae

2.3 分批发酵代谢曲线

分批发酵的实验条件如1.3.3，代谢曲线见图3。

图3 分批发酵代谢曲线Fig.3 Batch fermentation metabolic curve

由图3可知，0～4 h时菌体干质量较少，菌体处于适应期。4～14 h菌体进入对数生长期，菌体干质量迅速增加，在14 h时达到最大值15.06 g/L。

残糖曲线：0～4 h时菌体生长代谢活动较弱，残糖质量浓度变化较小。4～14 h进入对数生长期后菌体迅速利用蔗糖进行生长繁殖，同时代谢活动也在加强，残糖量迅速下降。在第14小时下降至25.51 g/L，直至发酵末期残糖量基本不再变化。

2.4 指数补料代谢曲线

图4 指数补料代谢曲线Fig.4 Exponential feeding metabolic curve

指数补料发酵的实验条件如1.3.4，指数补料过程中补加糖蜜时米曲霉的生物量、发酵罐中糖含量的变化情况见图4。

由图4可知，0～11 h菌体干质量变化较平稳，11～16 h干质量迅速增加。

残糖曲线：在发酵的0～11h内发酵罐中的残糖量由59g迅速降至43 g，在第11小时进行糖蜜的补料，补料的流加速度F=67 mL/h。

在发酵的第12小时通过指数补料有利于米曲霉菌体的生长，因此，在培养16 h之后，发酵液中可以达到极高的菌体浓度。米曲霉的生物量迅速的增加，最高为20.43 g/L。

3 结论

在摇瓶培养基础上比较10 L发酵罐分批发酵和指数补料发酵二种培养模式：10 L发酵罐分批发酵在未进行补料情况下米曲霉生物量达到15.06 g/L。由于分批补料缺乏营养补给而造成生长密度有限，菌体形态不同[12-13]也不利于氧的传递，难以实现细胞的高密度[14-15]。

10 L发酵罐指数补料发酵基于微生物指数生长理论通过指数流加糖蜜使得米曲霉大量快速生长。实验结果表明，10 L发酵罐中通过指数补料在保持菌体形态同时使得米曲霉生物量最大化，达到20.43 g/L。

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Exploration ofAspergillus oryzaefermentation with different cultivate modes

XIAO Jun1,ZHEN Yuguo1,2*,WANG Xiaolei1

(1.JAU-Borui Dairy Science and Technolgy R&D Center,College Animal Science&Technology,Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China;2.Technolgy Center of Changchun Borui Feed Co.,Ltd.,Changchun 130114,China)

Based on the shake flasks results,scaling up experiment ofAspergillus oryzaein 10 L fermentor was conducted.According to the effect of different mycelial morphology on the metabolite,fermenting should be stopped beforeA.oryzaehypha growing into flocculent.The exponential feeding results showed that the cell dry weight could reach 15.06 g/L when cultivated by batch fermentation for 14 h,which was 33%higher than shake flask culture.At the 16 h of fermentation,the cell dry weight was 20.43 g/L by exponential feeding,which was 26%higher than batch fermentation.

Aspergillus oryzae;fermentor;exponential feeding

TS201.3

A

0254-5071（2014）07-0048-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.010

2014-05-14

吉林省重大科技攻关项目资助（2012ZDGG006）

肖君（1989-），男，硕士研究生，研究方向为反刍动物营养。

*通讯作者：甄玉国（1970-），男，副教授，博士，研究方向为反刍动物营养。