吕迎春，樊竹青

（普洱学院，生命科学系，云南 普洱 665000）

逆流色谱技术在手性分离方面的应用

吕迎春，樊竹青

（普洱学院，生命科学系，云南 普洱 665000）

逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，其分离原理具有手性制备性分离的优势。以近年采用逆流色谱技术对手性化合物分离的应用进行了综述。

逆流色谱；手性化合物；手性分离；手性选择剂

手性化合物尤其是手性药物对映体的手性分离在药物研究和制药工业方面具有重要的意义，根据手性药物和药效关系表明，手性药物进人体后，其药理作用是通过与体内靶分子之间的严格手性匹配和分子识别能力而实现的［1］。因此尽管具有手性中心的外消旋体间有着极其相近的理化性质，但其药理和毒副作用却可能存在着差异。手性药物对映体间的药理活性差异主要表现在以下几个方面：①对映体有相同但程度有差异的活性；②一种对映体具有显著的活性但其对映体活性很低或无此活性甚至具有毒副作用；③对映体的药理活性相反；④对映体的药理活性互补；⑤对映体的药理活性不同。例如氧氟沙星（Ofloxacin）是第三代氟喹诺酮类广谱抗菌药，近年来研究证明左旋氧氟沙星抗革兰氏阳性菌及阴性菌的活性是右旋的8～128倍，是氧氟沙星外消旋体的2倍［2］；而左旋氧氟沙星用于治疗艾滋病毒引起的感染，其作用是外消旋体的2倍，右旋体却无此药理活性［3］。沙利度胺（反应停）的两个对映体中只有（R）－（＋）对映体作为镇静剂，用于缓解妊娠反应，而（S）－（－）对映体则具有强的致畸作用。

1992年，美国食品与药物管理局（FDA）已明确规定对于新药必须分别给出外消旋药物左旋体和右旋体的药效及药动学的有关资料。近年来，单一手性药物的销量呈连续增长的趋势，2000年达到1300亿元，2010年超过2500亿元。全球最畅销的500种药中，单一手性药物已经达到了270种以上。手性药物的开发正成为国内外药物研究、开发和销售的热点。美国、法国和日本等发达国家的一些药物生产厂家已把高效生产光学纯药物制品作为市场竞争的法宝。随着药物研究的逐渐深入，如何获得单一对映体药物成为了当前国际热门的研究方向［4］。

天然活性物质数量、种类十分有限，远远满足不了人类对单一手性化合物的需求。从近年研究看主要获得单一手性化合物的方法有三种：①手性源合成法：以手性源为原料合成其他手性化合物。②不对称合成法：是在催化剂或酶的作用下合成得到单一对映体化合物的方法。③外消旋体拆分法：是在手性选择剂作用下将外消旋体拆分成两个对映体，这种方法在工业生产上得到了广泛应用。据统计，大约65%的非天然手性药物是由外消旋体或中间产物的拆分获得的［5］。

1 逆流色谱在手性分离中的发展过程

逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，它具有两大优点：分离柱中的固定相不需要载体，消除了液固色谱由于使用载体而带来的吸附现象，特别适合于分离极性物质和具有生物活性的物质；特有的分离方式尤其适合于制备性分离，每次进样量及进样体积较大，同时具有高样品回收率。自1966年自第一台逆流色谱（Counter Current Chromatography，简称CCC）仪器问世以来，到目前为止，发展比较完善且具有实用意义的当属高速逆流色谱［6］（High－speed Counter Current Chromatography，简称HSCCC）。

HSCCC是早在20世纪80年代发展起来的一种液－液分配色谱分离技术，由美国国立卫生研究院Ito博士研制开发而成，其分离柱是聚四氟乙烯管绕成的螺旋柱，主要是建立在一种特殊的流体动力学平衡基础上，利用螺旋管的高速行星式运动所产生的不对称离心力场来实现对物质高效的分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数［7］。HSCCC仪器价格便宜，操作方便，分离柱中没有载体存在，在互不相溶的两相（固定相及流动相）中可方便地在任一相中添加手性分离材料，当其添加到固定相中相当于手性柱液相色谱，添加到流动相中相当于在流动相中含有手性添加剂的液相色谱；甚至可在同一相中添加两种甚至多种手性分离材料，以实现手性制备性分离的要求。尽管有这些优点，但CCC在手性分离中的应用还很少，究其原因主要在于CCC分离柱的分离效率较低，通常，手性选择剂对对映体的分离因子需要大于1.4才能实现在CCC的成功拆分［8］，而大多数情况下对映体之间的分离因子都很小，要实现对映体之间的CCC手性拆分相对来讲就比较困难，因此找到具有高选择性的手性选择剂和合适的两相溶剂系统对实现手性拆分是十分重要的。

液相色谱中的手性识别作用通常是采用“三点作用”模式进行解释。对于建立在单向性流体动力平衡体系的CCC的手性分离，一般是把手性选择剂添加到固定相中，利用CCC分离手性化合物常常选择一种手性选择剂（Chiral Selector，简称CS）并使其溶解于固定相中，通过该对对映体与CS在互不相溶的两相溶剂系统中具有不同的分配系数将其分离开来。

近年来环糊精、冠醚、大环抗生素、蛋白质、氨基酸、低聚糖和高聚糖、胆汁酸、金属离子配合物等已被用于手性分离研究中，但目前已报道用于CCC手性分离的非常有限，仅有为数不多的几种。

随着高效手性选择剂的发现和逆流色谱仪器的进一步更新完善，近年来逆流色谱在手性分离方面取得了一些成功应用。早在1982年由Hostettmann等［14］首先使用（R，R）－酒石酸－二－5壬基酯作为手性选择剂，在六氟磷酸盐存在时使用旋转小室逆流色谱拆分了（＋）－去甲麻黄碱。虽然没有达到基线分离，但这次研究向人们展示了利用逆流色谱对外消旋体实现分离的良好潜力。

2 逆流色谱的主要手性选择剂

2.1 L－脯氨酸衍生物

1979年，Pirkle等人首次将L－脯氨酸键合于硅胶上作为一种手性固定相，之后L－脯氨酸衍生物被广泛用于HPLC手性固定相研究。L－脯氨酸衍生物易对具有相似电荷特征的手性化合物进行拆分，因此成为了在逆流色谱中较早使用的手性添加剂。

1984年Takeuchi等从Davanoove等合成N－正十二烷基脯氨酸受到启发，将其作为当时流行的液滴逆流色谱的手性添加剂，对异亮氨酸对映异构体实现了基线分离，同时部分分离了（±）缬氨酸和（±）蛋氨酸。在逆流色谱中使用L－脯氨酸衍生物作为手性添加剂的相关文献报道见表1。

表1 L－脯氨酸衍生物作为手性添加剂分离手性化合物Table 1 L－proline derivatives as chiral additives to separate chiral compounds

2.2 β－环糊精衍生物

一分子β－环糊精（β－Cyclodextrin，β－CD）是由7个葡萄糖单元通过α－（1，4）苷键连接构成的环状低聚糖。每个葡萄糖分子有5个手性碳原子，故一分子β－CD具有35个手性碳原子。分子中具有中环并呈“V”型的圆筒状结构，它具有一定尺寸的疏水性空腔和亲水性外沿，对其外沿的基团进行取代，可得一系列衍生物，能作为“宿主”包络“客体”形成特殊结构的包合物。因此具有一定的立体选择和识别性能。在逆流色谱中使用β－CD衍生物作为手性添加剂的相关文献报道见表2。

表2 β－CD衍生物作为手性添加剂分离手性化合物Table 2 β－CD derivatives as a chiral additive to isolated chiral compounds

2.3 金鸡纳碱衍生物

Lindner［20］等发现从金鸡纳树皮中提取的奎宁（QN）和奎宁定（QD）可作为一种选择性很强的交换型手性添加剂。对其进行衍生化时，引入一个大取代基金刚烷基团，可生成选择性更强的手性添加剂，即金刚烷基氨基甲酰基QN－Selector 1和QN－Selector 2。它们易于接受和失去质子，故对氨基酸的分离具有较好的选择性，从而被应用于色谱、毛细管电泳（CE）、萃取等手性分离中。

Franco等［21］将奎宁和奎宁定进一步衍生化，使用逆流色谱技术在氨基乙酸缓冲溶液（pH＝6.0）／叔戊醇／甲醇／正庚烷（10∶5∶1∶5）两相溶剂系统，分离了DNB－亮氨酸、N－（3，5－二硝基苯甲酰基）－新戊基甘氨酸和N－（3，5－二硝基苯甲酰基）－β－苯丙氨酸。用0.1mol／L氨基乙酸缓冲溶液（pH＝8.0）／丙酮／甲基异丁基酮（2∶1∶2）最大分离了300mg的DNB－亮氨酸。用pH区带精制逆流色谱，最大分离了1.2g的DNB－亮氨酸。随后Gavioli等［22］也用合成的氢化奎尼定1，4－（2，3－二氮杂萘）二醚作为手性添加剂对2－（2，4－二氯苯氧基）丙酸实现了手性分离。

2.4 万古霉素

大环抗生素作为手性选择剂被广泛地应用到色谱、毛细管电泳等手性分析中。万古霉素易溶于水（＞140 mg／mL）、二甲基亚砜，微溶于甲醇，难溶于高级脂肪醇及弱极性溶剂。Duret等［23］应用CCC和CPC（行星式逆流色谱）选用甲苯和水作为溶剂系统，使万古霉素在水中的质量浓度达到140mg／mL，调整pH为4.7。采用双相洗脱方式，耗时50 min，实现了对50 mg D，L－丹磺酰正亮氨酸的基线分离。

在取得了上述的分离效果的同时，研究者也发现万古霉素要作为CCC的手性选择剂条件苛刻：首先溶剂系统中非芳香族化合物的加入就会降低万古霉素的手性选择性，因此必须有含有芳香性溶剂所构成的两相溶剂系统以使万古霉素能保留在水相中，同时万古霉素所要求的溶剂系统pH范围窄；其次为实现分离，万古霉素的浓度必须达到足够高而其相对分子质量又较大（Mr＝1400），因此要实现制备性应用还比较困难。

2.5 酒石酸及其衍生物

D－酒石酸或L－酒石酸是一种常用的酸性手性拆分剂，酒石酸及其衍生物在重结晶、萃取中均有应用，但用经典拆分获得的单体纯度不高。

1982年Domon等首先使用（R，R）－酒石酸－二－5壬基酯作为手性选择剂，在六氟磷酸盐存在时使用旋转小室逆流色谱部分拆分了±去甲麻黄碱。蔡瑛等［24］使用L－酒石酸作为手性拆分剂运用高速逆流色谱成功拆分了α－苯乙胺，最大拆分量可达到120 mg。随后申报人等用L－酒石酸尝试对氧氟沙星（R，S－oflxacin）进行手性分离也获得了成功。童胜强等［25］基于酒石酸－硼酸络合手性选择剂以氯仿－水相（0.05 mol·L－1）作为溶剂系统对普萘洛尔、吲哚洛尔和阿普洛尔3种药物进行了手性分离。作者所在课题组［26］通过手性萃取拆分研究确定了高速逆流色谱拆分氧氟沙星的两相溶剂系统为：乙酸乙酯：甲醇：水（10∶1∶9，v／v），固定相含有200 mmol／L的L－（＋）－酒石酸，拆分了20 mg R，S－氧氟沙星，实现了制备性分离的效果。

2.6 其他

此外牛血清白蛋白、纤维素和多糖、（－）－R－2－氨基丁醇、（＋）－（18－冠－6）－四羧酸等手性试剂也被应用到CCC中。

近20～30年间CCC被广泛用于分离天然产物、抗生素、蛋白质等。国外已有5本英文专著出版，我国目前也出版了两本中文专著。但应用该技术进行手性分离研究起步较晚，目前从作者所掌握的资料来看，这方面的文献不超过30篇。

总的来说，如何提高HSCCC技术进行手性分离仍然是一项具有挑战性的工作。逆流色谱分离手性化合物需要手性试剂具有良好的手性识别能力才能使对映体获得完全的制备性分离。HSCCC分离柱理论塔板数相对很低，性能优秀的手性选择剂的缺乏，都制约着手性分离的应用，合适的溶剂系统同样是分离获得成功必不可少的因素。从目前的研究来看从萃取、气相、液相、毛细管电泳中广泛应用的手性选择剂中，找到适合于CCC的手性添加剂是一种较好的选择途径。目前有研究提出如果能在逆流色谱固定相和流动相中添加不同的手性试剂，采用双相识别模式，如水溶性和脂溶性手性试剂的组合，这个方法若能实现则可能在一定程度上弥补逆流色谱分离效率低的缺陷。

［1］许关姐，刘玲玲.手性药物［J］.中国药学杂志，2001，36：152.

［2］Hayakawa I，Atarashi S，Yokohama S，et al.Synthesis and antibacterial activities of optically active ofloxacin［J］.Antimicrob.Agents Chemother，1986，29：163－164.

［3］Goodwin S D，Gallis H A，Chow A T.Pharmacology and safety of levofloxacin in patients with human immunodeficiency virus infection.Antimicrob［J］.Antimicrob.A-gents Chemother.，1994，38：799－804.

［4］Michael J.Single enantiomer drugs：new strategies and directions［J］.Chem.Ind.，1996，5：374－378.

［5］Gimenez F，Pennie R A，Crevoisier C.Stereoselective pharmacokinetics of mefloquine in healthy caucasinans after multiple does［J］.J.Pharm.Sci.，1994，83：824－827，.

［6］袁黎明.制备色谱技术及应用［M］.北京：化学工艺出版社，2005.

［7］Ito Y.New continous extraction method with a coil planet centrifuge［J］.J.Chromatogr.A，1981，207：161－169.

［8］曹学丽.高速逆流色谱分离技术及应用［M］.北京：化学工业出版社，2005.

［9］Takeuchi T，Horikawa R，Tanimura T.Complete resolution of D，L－isoleucine by droplet counter－current chromatography［J］.J.Chromatogr.，1984，284：285－288.

［10］Oliveros L，F.ranco P，Minguillon C，et al.Donor－acceptor chiral centrifugal partition chromatography：complete resolution of two pairs of amino－acid derivatives with a chiral II donor selector［J］.J.Liq.Chromatogr. Related Technol.，1994，17：2301－2318.

［11］Pirkle W H，Murray P G.Chiral stationaryphase design.use of intercalative effects to enhance enantioselectivity［J］.J.Chromatogr.，1993，641：11－19.

［12］Ma Y，Ito Y，Foucault A.Resolution of gram quantities of racemates by high speed countercurrent chromatography［J］.J.Chromatogr.A，1995，704：75－81.

［13］Ma Y，Ito Y.Chiral separation by high speed countercurrent chromatography［J］.Anal.Chem.，1995，67：3069－3074.

［14］Ma Y，Ito Y.Affinity countercurrent chromatography using a ligand in the stationary phase［J］.Anal.Chem.，1996，68：1207－1211.

［15］Ma Y，Ito Y，Berthod A.A chromatographic method for measuring KF of enantiomer－chiral selector complexes［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，1999，22：2945－2955.

［16］Delgado B，Pérez E，Satano M C，et al.Enantiomer separation by counter－current chromatography：optimisation and drawbacks in the use of L－proline derivatives as chiral selectors［J］.J.Chromatogr.A，2005，1092：36－42.

［17］Breinholt J，Lehmann S V，Varming A R.Enantiomer separation of 7－desmethylormeloxifene using sulfated beta－cyclodextrin in countercurrent chromatography［J］.Chirality，1999，11：768－771.

［18］Yuan L M，Liu J C，Yan Z H，et al.Enantioseparation of chlorpheniramine by high speed countercurrent chro-matography using carboxymethyl－β－cyclodextrin as chiral selector［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，2005，28：3057－3063.

［19］Ai P，Liu J C，Min Z，et al.Enantioseparation of Aminoglutethimide by High－speed counter－current chromatography using carboxymethly－β－cyclodextrin as chiral Selector［J］.Chin.Chem.Lett.，2006，17：787－790.

［20］Lindner W，Lammerhofer M，Maier N M.PCT／EP：1997，97／02888.

［21］Franco P，Blanc J，Oberleitner W R，et al.Enantiomer separation by countercurrent chromatography using cinchona alkaloid derivatives as chiral selectors［J］.Anal. Chem.，2002，74：4175－4183.

［22］Gavioli E，Maier NM，Minguillon C，et al.Preparative enantiomer separation of dichlorprop with a cinchonaderived dhiral selector employing centrifugal partition chromatography and high－performance liquid chromatography：A comparative study［J］.Anal.Chem.，2004，76：5837－5848.

［23］Duret P，Foucault A，Margraff R.Vancomycin as A chiral selector in centrifugal partition chromatography［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，2000，23：295－312.

［24］Cai Y，Yan Z H，Zi M，et al.Preparative Enantioseparation of DL－a－methylbenzylamine by high－speed countercurrent chromatography using L－（1）－tartaric acid as chiral selector［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，2007，30：1489－1495.

［25］Tong S Q，Zheng Y，Yan J，et al.Preparative enantiosepation of β－blocker drugs by counter－current chromatography using dialky L－tartrate as chiral selector based on borate coordination complex［J］.Chromatogr.2010，A，1263：74－78.

［26］Lv Y C，Yan Z H，Ma C，et al.Preparative enantioseparation of ofloxacin by high speed countercurrent chromatography using L－（＋）－tartaric acid as chiral selector［J］.J.Liq.Chromatogr.＆Related Technol.，2010，33：1328－1334.

Application of Countercurrent Chromatography on Chiral Separation

LV Ying－chun，Fan Zhu－qing

（The Faculty of Life Sciences，Puer College，Puer 665000，China）

Countercurrent chromatography is a liquid－liquid partition chromatography，without the use of support body or carrier.It is of advantage for chiral separation.In this paper its recent application in chiral separation is reviewed.

countercurrent chromatography；chiral compound；chiral separation；chiral selector

O658

A

1004-275X（2014）05-0044-05

12.3969／j.issn.1004-275X.2014.05.011

收稿：2014-05-14

基金项目：云南省教育厅科学研究基金（2013Y108）。

吕迎春（1973-），女，云南普洱人，硕士，副教授，主要从事手性分离研究。