毛金春 王 翔* 张荣华 靳欣欣 唐福州 熊延连 蒋 毅

1(重庆大学生物工程学院生物流变科学与技术教育部重点实验室， 重庆 400044)2(第三军医大学第一附属医院中西医结合科风湿病中心， 重庆 400038)

类风湿因子免疫吸附血液灌流材料的制备及其性能评价

毛金春1王 翔1*张荣华2*靳欣欣1唐福州1熊延连1蒋 毅2

1(重庆大学生物工程学院生物流变科学与技术教育部重点实验室， 重庆 400044)2(第三军医大学第一附属医院中西医结合科风湿病中心， 重庆 400038)

制备一种新型的类风湿因子(RF)免疫吸附剂并研究其性能。通过在氯甲基聚苯乙烯-二乙烯树脂(氯球)的表面接枝苯丙氨酸(PHE)，制备出可供临床应用的类风湿因子血液灌流吸附剂(PS-PHE)；体外动态灌流实验测定吸附剂的吸附率；体外动态洗脱实验测定RF的脱落量及脱落率；通过体外灌流模拟实验，检测灌流对血液成分的影响来评价吸附剂的选择性；体外凝血酶原时间(PTs)及凝血酶时间(TTs)检测实验验证材料的血液相容性。免疫吸附剂对类风湿因子IgA RF、IgG RF、IgM RF的吸附率分别可以达到45.21%±1.80%、56.02%±1.36%、52.40%±2.01% (n=5)，洗脱后脱落率分别为22.10%±1.65%、19.23%±1.06%、21.31%±1.35% (n=5)。全血灌流实验中材料对红细胞、血小板、总蛋白的吸附均在10%以下。同时体外凝血酶原时间(PTs)及凝血酶时间(TTs)测定结果显示PS-PHE能延缓凝血速度。结论PS-PHE对RF具有较高的吸附率及特异性并且表现出优良的血液相容性，在类风湿关节炎的临床治疗方面具有良好的应用前景。

类风湿因子；免疫吸附剂；苯丙氨酸

引言

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病[1]。致病机理尚不完全清楚，Roitt1977就提出了类风湿关节炎的病变机理，指出类风湿因子(RFs)在免疫复合物反应中起主要作用，在细胞免疫反应中起诱发作用。类风湿因子以变性IgG为抗原的一种自身抗体，主要有IgG、IgM类。目前国内主要采用激素类药物治疗，但是治疗周期长且带有很大的副作用。近年来，利用血液灌流的方式治疗类风湿关节炎逐步得到重视。早在1982年，Yamazaki就成功研制出聚乙烯醇凝胶-色氨酸免疫吸附剂(IM-TR)与聚乙烯醇凝胶-苯丙氨酸吸附剂(IM-PH)[2]。1990年,Kold用戊二交联IgG,合成lgG聚合体，该吸附剂对RF的清除率达到94%[3]。但是由于该吸附剂过于细小，故没能在临床上得到应用。随后，A蛋白吸附柱的研究取得一定的成果，吸附柱主要通过吸附免疫球蛋白起到治疗的效果，但A蛋白的高价格限制了其在临床上的应用[4]。

本实验室近几年来主要研究的方向是血液相容性良好的特异性吸附柱，肝素分子因其肝素具有抗凝血作用，并具有强亲水性，减少对红细胞、血小板的吸附，生物相容性良好；同时含有较多的化学活性官能团，而一直被采用作为载体材料及配基之间的连接臂，以期加强基底材料的亲水性，减少对红细胞、血小板等有形成分的吸附；并使灌流材料自身具备抗凝能力，减少凝血。前期制备的吸附材料有：聚苯乙烯接枝肝素的低密度脂蛋白特异性吸附材料[5]；以肝素为连接臂、多粘菌素为配基的针对内毒素特异性吸附树脂[6]；以肝素为连接臂、氨基酸为配基的针对内毒素的吸附树脂[7]。几种吸附剂均已完成吸附性能检测及全血灌流实验，在抗凝血及血液相容性方面表现出良好的性能。但还没有研制出针对类风湿因子(RF)的吸附剂，并且肝素及配基的接枝率较低。本研究如图1所示，以氯甲基聚苯乙烯(PS-Cl)为载体，肝素(HEP)为连接臂，苯丙氨酸为配基制备高肝素及配基接枝率的特异性吸附RF的吸附剂。本研究沿用肝素作为分子臂，以解决目前RF吸附剂基底材料亲水性不足的问题，同时增强吸附材料自身抗凝效果。苯丙氨酸由于其强疏水性、带有官能团-COOH的特点，因此对体内抗体及其抗抗体有很强的亲和作用[8]，主要的吸附原理是疏水作用及离子键作用[9]。该吸附剂HEP及PHE的接枝率较之前实验室所制吸附剂要高，同时通过反应方式的改变保留了PHE上的负电性基团-COOH，加强与RF的亲和能力。通过吸附效率、选择性及血液相容性的检测表明，该吸附剂都表现出良好的性能，有望应用于临床难治性类风湿关节炎的治疗。

1 材料与方法

1.1主要仪器与材料

仪器：紫外-可见分光光度计(TU-1901)(北京普析通用仪器设备有限责任公司，中国)、数显智能控温磁力搅拌器SZCL-2型(巩义市予华仪器有限责任公司，中国)、血液细胞分析仪(BC-2000，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，中国)、恒流泵(HL-2，上海青浦沪西仪器厂，中国)全自动免疫分析仪傅里叶变换红外光谱仪(Spectrum GX型、Perkin Elmer公司，美国)、真空干燥箱(DZX-3型 上海福玛实验设备有限公司，中国)、全自动血液生化分析仪(BS-200,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,中国)。

试剂：类风湿因子ELISA试剂盒(德波生物试剂有限公司,中国)、氯甲基树脂(天津南开合成科技有限公司，中国)、肝素钠(百萃生物科技有限公司，中国)、乙二胺，EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimid)，Sigma公司，美国)、NHS(N-hydroxy-succinimide，Sigma公司，美国),柠檬酸缓冲液,甲苯胺蓝(国药集团化学试剂有限公司，中国)、L-苯丙氨酸(PHE)、正己烷、磷酸缓冲液(pH=7.4，北京鼎国生物技术有限公司)、所用试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1氨基化氯球的制备

将5 g氯球与40 mL乙二胺加入到DMF溶液中，氯甲基与乙二胺的摩尔比小于1∶2。体系在500 mL三角烧瓶中75℃反应7 h。用乙醇与蒸馏水交替冲洗至中性，烘干得到淡黄色的氨基化氯球(EDR)红外检测氨基。

1.2.2在氨基化氯球上接枝肝素

以0.02 M Na2HPO4，0.01 M柠檬酸，0.17 gEDC与0.2 gNHS(质量比为5∶6)配制柠檬酸缓冲液100 mL，用0.1 M NaOH调节pH至4.7。在100 mL柠檬酸缓冲液中加入0.6 g的肝素，在0℃下超声10 min后将5 g氨基化氯球加入到反应体系中，常温下震荡反应24 h。蒸馏水冲洗数遍，干燥得到肝素化氯球(PS-HEP)。

1.2.3PS-HEP接枝苯丙氨酸(PHE)

图2是EDC-NHS的催化酰胺缩合反应的机理[10]，EDC通过与-COOH反应形成水溶液中不稳定O-酰基异硫脲中间体，O-酰基异硫脲中间体在NHS存在的情况下，可以转变为半稳定的胺活性NHS酯，可以将缩合反应分解成两步进行。在PS-HEP连接PHE的反应中，肝素和苯丙氨酸都存在-NH2与-COOH，-COOH是负电性基团，能与类风湿因子产生静电吸附作用力，因此希望尽量使用肝素-COOH与苯丙氨酸的-NH2反应，这样能最大限度地保留氨基酸-COOH的比例。所以按以下步骤进行，在含有5 g PS-HEP 100 mL柠檬酸的缓冲液中0℃超声10 min后加入0.6 g PHE,室温下反应24 h。蒸馏水冲洗数遍，抽滤后干燥得到PS-PHE,滤液收集以供检测苯丙氨酸的接枝量用。

1.2.4氯球表面氨基表征

将制备好的氨基化氯球真空干燥后，采用傅立叶红外光谱仪对其进行表面分析，通过观察氯球与氨基化氯球的吸收峰来确定氯球经乙二胺活化前后所发生的变化。

1.2.5肝素接枝量的测定[11]

甲苯胺蓝比色法检测肝素的固载量，在肝素钠与甲苯胺蓝的混合溶液中，肝素钠能与甲苯胺蓝紧密结合，之后将其用正己烷萃取去除；用紫外分光光度计测定630 nm处溶液的吸光值，浓度在40 μg/mL以下的肝素钠的溶度呈很好的线性关系，所以能先绘制出吸光值关于肝素钠浓度的标准曲线。在试管中加入1 g PS-HEP、4 mL 0.2%NaCl溶液、1 mL 0.005%的甲苯胺蓝溶液混合均匀，于恒温振荡箱37℃反应2 h。离心取样品试管上层液体2 mL，加入分液漏斗中，然后各加入2 mL正己烷，剧烈振荡，萃取一定时间后在紫外分光光度计630 nm处测其吸光度，并比照标准曲线计算肝素固定量。通过改变肝素初始浓度确定最佳反应浓度。

用材料与甲苯胺蓝溶液混合、离心后测定溶液吸光值，再根据已经绘制的吸光值关于肝素量的标准曲线就可以计算出材料表面肝素接枝量。

1.2.6氨基酸固载量的测定

首先配制氨基酸溶液，在紫外可见分光光度计上扫描，选取紫外最强吸收峰处为测定波长，然后配制一定浓度的氨基酸梯度溶液，在设定的波长下测定其紫外吸收，制作出吸光度对氨基酸浓度的标准曲线。冲洗载体至紫外吸收为0，检测洗脱液的紫外吸收，根据标准曲线计算洗脱液中的浓度。再根据反应前后氨基酸量的变化计算氨基酸的接枝量。按式(1)计算苯丙氨酸固载量

(1)

式中,W:苯丙氨酸的接枝量(μg/g)；m:苯丙氨酸初始质量(g)；c:洗脱液中氨基酸的浓度(mg/mL)；v:洗脱液体积(mL)；M：PS-HEP的质量(g)。

1.2.7体外类风湿因子动态吸附实验

取类风湿因子阳性患者的血清做体外类风湿因子的吸附实验，将5 mL血清加入到自制血液灌流系统中分别在0.5、1.0、2.0 mL/min流速下进行灌流，灌流柱中材料为1 g。每隔0.5 h取样用ELISA试剂盒测定各个时间血清中IgA RF、IgG RF、IgM RF的含量，测定吸附量。进行5组重复实验。根据式(2)及式(3)计算吸附率及吸附量：

(2)

(3)

式中，ARt(adsorption rate)为吸附率；ACt(adsorption capacity)为吸附量(IU/g)；C0与Ct分别为吸附前后类风湿因子的浓度(IU/mL)，V为实验中血浆用量(mL)。

1.2.8体外类风湿因子动态洗脱实验

动态吸附两小时后用5 mL0.9%的生理盐水在2 mL/min流速下进行循环冲洗，每隔15 min对冲洗液进行检测，计算脱落含量，确定吸附材料上RF残余吸附量。进行5组重复实验。按照式(4)和式(5)计算剩余吸附量及剩余吸附率

RCt=ACm-ECt

(4)

(5)

式中，RCt(Remaining capacity)为剩余吸附量(IU/g)；ACm为吸附平衡时最大吸附量(IU/g);ECt(elution capacity)表示脱落量(IU)；AbRt(abscission rate)表示脱落率。

1.2.9吸附选择性检测

高选择性是衡量灌流材料是否安全的重要指标，所以进行了选择性的检测。用自制血液灌流器，装入1 g 吸附剂，灌流前使用肝素钠生理盐水冲管3次，进行离体血液灌流实验。取5 mL健康人的血样灌入到灌流器中循环吸附2 h，分别附取血样用血液细胞分析仪和常规全自动生化分析仪测定血细胞及血液生化指标变化。

1.2.10血液相容性检测

凝血酶时间及凝血酶原时间能反应PS-PHE对凝血机制的影响[12]，鉴于此进行了凝血酶时间及凝血时间测定实验，操作步骤按照说明书进行。

2 结果

2.1红外检测氨基化氯球

图3为氯甲基树脂氨基化前后的的红外光谱。发现氨基化反应之后，个别特征峰出现明显变化，3 300～3 377 cm-1之间出现了氨基(-NH2)的伸缩振动峰，而表征了氯甲基强化的=C-H的面内弯曲振动峰1 265 cm-1消失了，说明乙二胺与苯环上的氯甲基发生了反应，将氨基成功引入到了氯甲基树脂上[13]。

2.2肝素的固定量

肝素的固定量直接影响着苯丙氨酸配基的固定及肝素抗凝效果的发挥，应寻找肝素最佳起始用量及反应条件，使肝素的固定量最大。在之前研究基础上本实验考虑了肝素的起始浓度对肝素固定量的影响。图4是肝素的固定量受肝素起始用量的曲线，可见接枝肝素所需的最佳肝素浓度为6 mg/mL，肝素的最大接枝量为(33.80±1.02)μg/g。

2.3苯丙氨酸的固载量

苯丙氨酸作为PS-PHE的配基，它的固载量直接关系到对RF的吸附效率，本研究的目标是在肝素分子臂上接枝上尽可能多的苯丙氨酸，以便于其吸附作用的发挥。由此，本实验测定了不同的苯丙氨酸的初始用量对苯丙氨酸固定量的影响，如图5所示。由图5可知，接枝苯丙氨酸的所需的最佳苯丙氨酸浓度为6 mg/mL，苯丙氨酸的接枝量为(8.00±0.25) mg/g。

2.4吸附量检测

吸附量检测能直接反应PS-PHE对RF的吸附能力，吸附前后RF的浓度用酶联法试剂盒(二步法)测定。图6～图8为在不同流速下的PS-PHE对RF的吸附动力学曲线。笔者发现，随着流速的加大，相同时间PS-PHE对RF的吸附率也随之下降，这是由于低流速下吸附材料与RF的作用时间延长，RF能很好地渗进材料的内部与配基发生结合，使吸附更加充分导致的，考虑到临床实际的灌流流速，采用2 mL/min作为灌流流速。在1 h后基本能达到总吸附量的80%以上，2 h后均能达到吸附平衡，对IgA RF、IgG RF、IgM RF的平均吸附率分别为 45.21%±1.80%、56.02%±1.36%、52.40%±2.01%。图9是在2 mL/min的流速下RF吸附率随时间的变化曲线，结合洗脱曲线发现材料对IgG RF的亲和力最强，IgM RF其次，IgA RF最弱。

2.5吸附稳定性检测

PS-PHE吸附剂对RFs的吸附性能在实验中已经得到初步的探究，但是吸附量测定实验仅能检测到RFs在吸附剂表面的沉积量，可能包括疏水性结合、静电性结合、由于空间限制而导致的物理性的堆积。物理性的堆积量容易受血液流动的影响，从吸附剂上脱落，又重新回到血液中。鉴于此，本实验设计中又加入吸附稳定性实验，以检测吸附剂对RFs的疏水、静电吸附等强吸附作用的量，考察RFs在吸附剂上的结合稳定性。

图10～图12是洗脱时间对RF吸附的影响，已经达到吸附平衡的材料洗脱后剩余吸附量在半小时内下降到稳定的水平，IgA RF、IgG RF、IgM RF脱落率分别占各自总吸附量的22.10%±1.65%、19.23%±1.06%、21.31%±1.35%，洗脱实验表明PS-PHE对IgGRF的疏水及离子键作用力较强，具有较大的吸附能力。

2.6吸附选择性检测

吸附选择性是评价生物医用材料的重要指标之一[14]。本实验对正常人血液进行了体外血液动态灌流实验，表1是体外模拟灌流后血液成分的变化。灌流2 h后，白细胞、红细胞及其血小板的量有所减少，下降率分别为5.26%±1.02%、4.44%±0.98%、5.61%±1.23%；血浆蛋白的下降率也在10%以下，但都在临床可接受范围内[14]。但对球蛋白的吸附也较大，因为球蛋白与RF具有相似的结构，故吸附率也会达到较高的水平。由此表明该材料的选择性良好，可满足临床应用的要求。

2.7血液相容性的检测结果

医用血液灌流材料不仅要具备高吸附率、高选择性，还应具有一定的抗凝血功能。这样不仅能在灌流过程中减少凝血，还能减少在灌流过程中外加抗凝剂的量，使灌流过程对血液的不利影响得到减弱[12]。所以我们进一步对过程中所涉及材料及吸附剂进行抗凝血的评价，表2是材料的凝血酶原时间(PTs)及凝血酶时间(TTs)测定结果，由表2我们可以看出PS-HEP由于表面接枝的肝素分子，PTs及TTs值较大,表明具有很强的抗凝血效果；PS-PHE由于在肝素分子链上进一步接枝了苯丙氨酸，但肝素分子内的硫酸根离子得到保留，PTs及TTs比空白组大，材料依然具有抗凝效果，但较PS-HEP有所减弱。

3 讨论与结论

理想的免疫吸附剂需要首先具备生物医用材料的一般特性如：良好的力学性能，易于灭菌；不会有配基的脱落，良好的结构稳定性；无毒，不会引起机体的免疫反应，不会加速凝血，不引起溶血等良好的血液相容性。除此之外，吸附材料需对目标物质具有高吸附率及高选择性和特异性。

本实验室研制的吸附材料PS-PHE是以氯甲基树脂作为基底材料，乙二胺活化后嫁接肝素分子，发挥其空间结构效应与生物学功能，作为分子臂以固定PHE配基，以期通过化学放大效应来增强苯丙氨酸对RF去除效率，同时肝素作为良好的抗凝剂能增强材料的血液相容性。PHE能对RF起到离子吸附及疏水吸附效果。经过对接枝肝素及苯丙氨酸的条件摸索，肝素的接枝率达到(33.80±1.02) μg/g，苯丙氨酸的接枝率最高达到(8.00±0.25) mg/g。肝素接枝量的提高能有效增加吸附率的生物相容性，较比之前本实验室研制的产品在血液相容性方面有所改善。实验结果表明PS-PHE对RF具有较高的吸附效率，对IgG RF的吸附率最高达到56%。吸附实验表明吸附剂对于RFs具有较高的吸附率及吸附通量。但是吸附量检测仅能检测到RFs在吸附剂表面的沉积量，可能包括疏水性结合、静电性结合、由于空间限制而导致的物理性的堆积。本课题所关注的亲和作用是疏水作用及静电作用这两类强吸附作用力，物理性的堆积量容易受血液流动的影响，从吸附剂上脱落，又重新回到血液中。鉴于此，本课题设计中又加入吸附稳定性实验，以检测吸附剂对RFs的疏水、静电吸附等强吸附作用的量，考察RFs在吸附剂上的结合稳定性。我们发现将吸附上RF的材料进行洗脱1 h后，脱落率稳定在20%左右，IgG RF的洗脱率为19%，说明材料对RF的吸附较牢固，血液冲刷对吸附率的影响较小。吸附选择性实验测定了灌流前后血液成分的变化。灌流2 h后，白细胞、红细胞及其血小板的量有所减少，下降率分别为5.26%±1.02%、4.44%±0.98%、5.61%±1.23%；血浆蛋白的下降率也在10%以下，但都在临床可接受范围内[14]。由此表明该材料的选择性良好，满足临床应用的要求。为了表征材料对凝血的影响，进行了PTs及TTs的检测，结果显示吸附材料有适度延缓凝血的作用，并且不会造成凝血异常，表明吸附材料具有良好的血液相容性。综上所述，PS-PHE对RF的吸附率达到50%以上，吸附前后对血液其他成分的影响不大，并且表现出较佳的血液相容性。目前特异高血液相容性的吸附剂仍在探索中，从实验数据上分析，本课题所用肝素连接臂在增加吸附剂的血液相容性方面确有比较好的效果，但仍需进一步的研究，找到更加有力的理论支撑。同时，以氨基酸作为配基吸附RF的具体作用机理尚没有完全研究清楚，这也一定程度影响着针对RF的特应性吸附剂的研制，所以对PS-PHE分子结构的解析及吸附机理的研究需要更加深入的研究。

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StudyonPreparationandPropertiesofImmuneAdsorbentforRheumatoidFactorremovalinHemoperfusion

MAO Jin-Chun1WANG Xiang1*ZHANG Rong-Hua2*JIN Xin-Xin1TANG Fu-Zhou1XIOG Yan-Lian1JIANG Yi2

1(KeyLaboratoryofBiorheologicalScienceandTechnology,MinistryofEducation,BioengineeringCollege,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China)2(ThirdMilitaryMedicalUniversity,TheFirstAffiliatedHospital,IntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,DepartmentofRheumatologyCentre,Chongqing400038,China)

In this work we prepared an adsorbent (PS-PHE) aiming to remove rheumatoid factors and studied its performance. In the PS-PHE, the chloromethyl resin acted as carrier grafting with the linker of heparin, to which phenylalanine was connected. The adsorption rate of adsorbent was investigated byinvitroRF dynamic perfusion. We conductedinvitroelution experiment to measure the abscission rate of RF. Selectivity of adsorbent was evaluated by blood components before and after perfusion. The prothrombin time (PTs) and thrombin time (TTs) detection in vitro verify the blood compatibility of adsorbent. The adsorption equilibrium was reached in less than two hours, and 90% of the maximum adsorption capacity was reached only under 1 hour, while the adsorption rate of IgA RF, IgG RF and IgM RF in serum was 45.21%±1.80%、56.02%±1.36%、52.40%±2.01% (n=5). After elution, the abscission rate of IgA RF, IgG RF and IgM RF was 22.10%±1.65%、19.23%±1.06%、21.31%±1.35% (n=5). After perfusion experiment, the variation rates of albumen and red blood cell were both less than 10%. The detection results of PTs and TTs showed PS-PHE delayed the coagulation rate. In conclusion, PS-PHE has higher absorption rate to RF and good blood compatibility, showing good application prospects.

rheumatoid factor; immune adsorbent; phenylalanine

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 03.011

2013-11-25， 录用日期:2014-04-09

重庆市科委科技计划攻关项目(cstc2011ac5193)；重庆市科委基地建设费(cstc2011pt-gc0030)

R318

A

0258-8021(2014) 03-0335-08

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: xwangchn@vip.sina.com.cn; zhrhlggg@163.com