李理，刘冶，满朝新，姜毓君,

（1.东北农业大学 食品学院 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.筑波大学生命环境科学研究科，日本筑波3058572；3.东北农业大学 黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨 150028）

0 引 言

γ-氨基丁酸 （gamma-aminobutyric acid，GABA）又名4-氨基丁酸、γ-氨酪酸，是一种在自然界广泛分布的非蛋白质氨基酸，动物、植物和微生物甚至一些生存在极端环境中的微生物体内均分离得到了GABA。GABA早期被研究者确定为哺乳动物神经中枢的一种抑制性神经递质，此后GABA其他生物学功能也逐渐被发现并得到确认[1]。Hayakawa等人通过比较GABA灌胃自发性高血压症小鼠和血压正常小鼠后的收缩压，证明GABA可以通过抑制交感神经释放去甲肾上腺素来抑制血压的升高[2]。临床实验还证明适当提高病人血液中GABA水平可有效减少抑郁和神经紊乱的发生，具有一定镇静安神和营养神经的功效[3,4]。近年来，更多与GABA相关的生物学特性也相继被报道。口服一定量GABA可以增加血浆中生长激素含量，促进脑部蛋白的合成[5]；抑制由丙二醛引起的一系列脂质过氧化反应，减缓氧化对机体造成的损伤[6]。不仅如此，GABA还能够减少周身性免疫因子的产生并抑制炎症的发生[7]。正因为GABA具有上述多种生理方面的益生作用，使得它成为近年来食品和药品领域关注和研究的重点。

目前，GABA的合成方法主要有化学法和生物法。与化学合成相比，生物合成具有方法简单、条件温和、合成效率高以及耗能低等优势[8]。生物合成主要是利用代时短、易培养的微生物，以谷氨酸（Glu）或其盐类为底物通过谷氨酸脱羧酶对底物进行脱羧从而合成GABA。由于乳酸菌具有特殊的生理活性如免疫调节，促进营养吸收、改善肠道内环境，抑制致病菌增殖等[9,10]，另外还被认为是食品安全级的微生物，因此近年来食品和药品行业将乳酸菌作为合成GABA的首选，同时相关领域的专家和学者也在对如何提高乳酸菌合成GABA的能力进行深入研究。本综述主要从产GABA乳酸菌的种类及来源、产GABA乳酸菌的筛选方法、乳酸菌合成GABA的影响因素以及高产GABA乳酸菌的应用等方面来进行介绍和总结。

1 产GABA乳酸菌的种类及来源

具有合成GABA能力的乳酸菌种类较多且合成能力因菌株的种属不同而差异较大。许多研究表明，来源多样的短乳杆菌Lactbacillus brevis合成GABA的能力比较突出。泡菜是高产GABA乳酸菌的重要来源之一，从泡菜中筛选得到高产GABA的短乳杆菌也比较多，Park和Oh从韩国传统泡菜中分离得到一株产GABA的短乳杆菌，在MRS培养基中其GABA产量为8 mmol/L左右[11]。Min和Keun也从韩国泡菜中分离得到若干种能够产生GABA乳酸菌，其中一株短乳杆菌GABA的产量也比较高[12]。中国传统发酵食品酸菜中也分离到高产GABA的短乳杆菌[8]。除泡菜和酸菜外，研究人员在其他发酵食品中也分离得到了具有合成GABA能力的短乳杆菌，Siragusa等人从意大利干酪中分离出一株短乳杆菌，其GABA产量为15.0 mg/kg干酪[13]。不仅如此，2012年首次从人体肠道中分离出一株能够利用谷氨酸作为底物合成GABA的短乳杆菌Lb.brevis DPC6108[14]。另外，一些从其他来源分离到的产GABA的短乳杆菌也有相应报道，如Lb.brevis NBRC12,005[15]，Lb.brevis IFO-12005[16]和Lb.brevis GABA 057[17]。

除短乳杆菌外，植物乳杆菌[13]、副干酪乳杆菌[18]、布氏乳杆菌[16]和德式乳杆菌[13]等也都具有较好的GABA合成能力。从干酪中分离出来的植物乳杆菌Lb.plantarum C48在乙酸钠缓冲液和复合发酵面粉中GABA的产量分别为16.0 mg/kg[13]和504 mg/kg[20]；Di等人也从干酪中分离出一株高产GABA的植物乳杆菌Lb.plantarum DSM19463，MRS纯培养条件下可产生498.1 mg/L的GABA[21]。泡菜中也分离得到了一些具有合成GABA能力的植物乳杆菌，如Lb.plantarum KCQ1，Lb.plantarum KC-R1和Lb.plantarum KC-R36[12]。不仅乳杆菌能够合成GABA，乳酸菌家族中一些球菌，如嗜热链球菌和乳酸乳球菌及其亚种[22]也能够生成GABA且产量各异。有文献报道，泡菜[23]，酸奶[24]，干酪[25]和干酪发酵剂[26]中都分离得到了能够合成GABA的乳酸乳球菌，其中Lu等人从泡菜中分离出来的Lactococcus.lactis subsp.lactis合成GABA能力最强，MRS中GABA产量可达到7.2 g/L[23]。除上述分离于乳制品中的乳酸菌外，来源于发酵水产品的香肠乳杆菌Lb.farciminis[27]，来源于泡菜的清酒乳杆菌Lb.sakei B2-16[28],肠系膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，乳明串珠菌Leuconostoc lactis和绿色魏斯氏菌Weissella viridescens[12]以及来源于发酵肉质品中的戊糖片球菌Pediococcus pentosaccus HN8和Lb.namurensis NH2[29]都能够合成GABA。

从上述文献报道中不难发现，合成GABA能力较强的乳酸菌主要有短乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和乳酸乳球菌，且这些菌种的来源大多集中在一些酸性发酵食品中，如泡菜、干酪和酸奶等。这些事实表明大部分能够合成GABA的乳酸菌应该是嗜酸性的，并且能够利用酸性环境中某些特殊成分不断产生并积累GABA，这一点不仅为产GABA乳酸菌的筛选做出了提示，也说明了pH是影响乳酸菌合成GABA的因素之一。

2 产GABA乳酸菌的筛选方法

筛选具有合成GABA能力的乳酸菌是相关研究工作的第一步，目前主要以GABA的产量作为筛选依据。GABA的检测方法较多，例如氨基酸分析仪法[21]、气相色谱法[26]、高效液相色谱法[22],液相色谱串联质谱法[30]和流动注射分析法[31]。上述几种方法检测准确、灵敏度高，但需要昂贵的仪器和复杂的样品前处理，对于直接从复杂基质中筛选菌株更加费时费力，因此为了减少筛菌工作量并降低成本，有必要先采用较简单的方法对菌株进行初步筛选。Li等人[32]从泡菜中分离出1 000多株乳酸菌，他们先采用纸层析色谱法对具有合成GABA能力的菌株进行初步筛选，再利用高效液相色谱法对疑似菌株GABA产量进行测定，最后采用液相-质谱联用的方法对结果进行验证。采用不同手段对乳酸菌进行分阶段筛选不仅保证了筛选结果的准确性，同时大大节约了筛选时间和成本。

除了分级筛选的方法，还有一些操作简单、平行性好，适合样本数量较大的菌株筛选的方法。薄层色谱法（TLC）是一种快速分离和定性分析少量物质的检测技术。Cho等人[19]将从泡菜中分离到的乳酸菌经过培养后，培养上清液采用TLC检测其中GABA含量，由于此方法不需要复杂的检测设备和繁琐的样品处理，许多产GABA乳酸菌的筛选都选择此种方法，或者做为初筛的方法[11,16,18]；还有一种方法是基于一系列与GABA相关的酶反应，利用生成特定产物间接检测GABA含量，同时结合光谱法和酶标仪，使得一次可以检测96个样品，实现了产GABA乳酸菌的高通量筛选，这种方法与高效液相色谱法相比具有快速、简便的优势[15]。

选择一种合适的GABA定性或定量的方法对于产GABA乳酸菌筛选工作的顺利进行至关重要，考虑到实验条件、样本大小、筛选成本和其他因素的限制，有时可能需要多种检测手段结合起来才能完成菌株筛选工作。

3 乳酸菌合成GABA的影响因素

影响乳酸菌合成GABA的因素有很多，不同发酵条件会影响GABA的产量和产率，其中主要因素有底物Glu及其盐类的添加量、辅酶磷酸吡哆醛(PLP)的添加量、pH值、发酵时间和发酵基质。这些主要因素之所以能够显著影响GABA的产量其原因在于上述因素能够影响GABA酶促反应中关键酶—谷氨酸脱羧酶的活性，许多针对乳酸菌GABA产量优化的研究也正是通过优化谷氨酸脱羧酶的活性来实现提高菌株合成GABA的能力。

3.1 底物及辅酶的影响

乳酸菌中GABA主要是通过谷氨酸脱羧酶催化底物Glu及其盐类进行脱羧反应产生的，因此底物浓度会直接影响GABA产生的数量和速率；另外PLP是转氨酶和脱羧酶类的辅酶，它能够促进谷氨酸的脱羧，促进GABA的产生，因此辅酶的添加量也是影响GABA产量的重要因素之一。在MRS培养基中添加一定量的Glu和PLP使得Lb.paracasei NFRI 7415合成GABA的能力明显提高，当底物添加量为500 mmol/L时GABA产量最高可达到 161 mmol/L[18]。Lb.plantarum DSM1946在添加了18.4 mmol/L L-谷氨酸钠（L-MSG）的葡萄汁和乳清中GABA的产量为4.83 mmol/L，较不添加底物和辅酶时有所提高[24]。短乳杆菌是产GABA能力较强的菌株之一，其合成GABA能力也受到底物和辅酶浓度的影响。Hang等人[33]和Li等人[34]都通过优化L-MSG和PLP的添加量来提高短乳杆菌GABA的产量。还有文献报道，在Glu含量比较丰富的发酵豆乳中短乳杆菌产GABA的量高于其在一般发酵乳中的产量[35]。但也有文献指出，适量提高培养基中谷氨酸钠的浓度对一些乳酸菌GABA的产量没有影响[22]，这表明Glu及其盐类对于提高乳酸菌产GABA的能力具有一定的种属特异性，或者在这些乳酸菌中可能存在其他GABA合成的途径。类似的，对于某些乳酸菌而言，PLP的增加也没有提高其合成GABA的能力，这可能是由于基质中或菌株本身就能够提供充足的内源性辅酶[21]。

3.2 发酵pH值的影响

乳酸菌合成GABA的能力主要受到谷氨酸脱羧酶活性的影响，不同乳酸菌中谷氨酸脱羧酶的性质不同导致了GABA最大量积累时的pH值具有种属特异性。植物乳杆菌Lb.plantarum DSM1946在pH为6.0时合成GABA的速率最大[21]；副干酪乳杆菌Lb.paracasei NFRI 7415产GABA的最适pH为5.0左右[18]；而短乳杆菌Lb.brevis GABA057能够在更酸性的环境下，pH约为4.2时将10%的底物转换成GABA[17]。在干酪中筛选得到的合成GABA能力较强的几株乳酸菌，它们产GABA的最适pH值也大都集中在4～6的范围内[13]，上述文献表明大部分乳酸菌的谷氨酸脱羧酶是酸性依赖的，但也有例外的情况。LU等人[23]优化了Lc.lactis富集GABA的发酵条件，他们发现该菌株最大程度积累GABA的pH值为7.5～8.0，当pH超过8.0后菌株合成GABA能力明显下降，这说明了就发酵pH值这一影响因素来说，乳杆菌和乳球菌积累GABA的条件差异较大。

3.3 发酵时间的影响

GABA作为乳酸菌的一种次级代谢产物其积累量受发酵时间影响较大，每种乳酸菌都有各自的生长特性，从发酵开始在不同的时间点进入对数生长期和稳定期，因此GABA的最大积累时间也有所不同。以乳杆菌为例，副干酪乳杆菌Lb.paracasei NFRI 7415最大积累GABA的时间是植物乳杆菌Lb.plantarum DSM19463积累时间的2倍[18,21]。另外，发酵时间、发酵温度和发酵pH值会相互作用从而影响GABA的最终积累量。短乳杆菌Lb.brevis GABA 100在黑树莓汁中发酵第15天时GABA的积累量达到最大，而当pH和发酵温度有较大变化时，则在第12天就达到了最大积累量[36]。一些研究还通过在发酵过程的不同时间点添加底物或辅酶来增加乳酸菌合成GABA的量，这样做也是考虑到发酵时间会对终产物积累量产生影响[22,23]。

3.4 发酵基质及培养基添加物的影响

培养基中不同种类的碳源会直接影响乳酸菌GABA的产量。在阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖等多种碳源中，短乳杆菌Lactobacillus brevisNCL912合成GABA的最佳碳源是1.25%的葡萄糖[34]。Raffaella等人为了探索Lactobacillus plantarum DSM19463产GABA的最佳碳源，他们向培养基中添加不同量的葡萄汁，结果发现当葡萄汁的添加量为总碳源的4%时，菌株合成GABA的量最大[21]。Lu等人还采用D-optimal mixture design的方法优化了培养基中三种主要营养物质的添加比例，当黑米汁∶发酵大豆汁∶酶解脱脂乳=33∶58∶9时乳酸乳球菌Lc.lactic B产GABA的量最高，可达到6.41 g/L[24]。除了培养基中主要的营养成分会影响GABA的积累，一些额外添加的成分也会影响乳酸菌合成GABA的能力。很早就有文献报道，适量的硫酸根离子可以增加谷氨酸脱羧酶的活性，促进GABA的合成且具有浓度依赖性。向培养基中分别加入硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁短乳杆菌Lb.brevis IFO 12005合成GABA的量均有不同程度的提高，其中硫酸铵提高的效果最为明显[37]。在一些能够产生GABA的植物和谷物中，某些金属离子（如钙离子）作为酶的活性中心也可以增加谷氨酸脱羧酶的活性，有利于GABA的积累[38]，但在乳酸菌发酵过程中添加适量的钙离子能否增加谷氨酸脱羧酶的活性并提高GABA产量还需要进一步研究和验证。

4 高产GABA乳酸菌在乳制品中的应用

近年来，人们对健康的关注度越来越高，消费者希望购买具有益生保健功能食品的愿望也越来越强烈。γ-氨基丁酸是一种天然的生物活性物质，开发富含GABA的保健食品具有广阔的市场价值；同时乳酸菌作为一种公认的食品级安全微生物其多种保健功能已逐渐被认可，因此使用具有产GABA能力的乳酸菌作为发酵剂生产富含GABA的乳制品能够将乳酸菌和GABA两者的益生功能加以结合。

目前，许多研究者都致力于开发富含GABA的乳制品，如酸奶[35]、发酵豆奶[39]、干酪[26]、发酵乳及发酵乳饮料[40]等等，但由于乳酸菌合成GABA的能力各异，且乳酸菌的种类及其作为发酵剂时的添加量都对发酵乳制品的感官品质尤其是风味影响较大，因此选择合适的产GABA的菌株作为发酵剂是生产富含GABA乳制品的关键。另外，已报道的能够产GABA的乳酸菌大部分需要以谷氨酸或其盐类作为底物，因此向乳制品中添加较多的谷氨酸或谷氨酸盐以保证GABA的产量不仅影响乳制品本身的风味和口感，也增加了产品生产成本，同时谷氨酸摄入量较多也不利于机体健康。今后，研制富含GABA发酵乳制品时应当不仅考虑发酵剂乳酸菌产GABA的能力，同时更应该注意菌株是否能将底物尽可能多的转化成我们需要的产物，以减少底物残留对产品口感的影响。因此，筛选能够高效利用谷氨酸或谷氨酸盐产生GABA的乳酸菌，将会是开发富含GABA的发酵乳制品未来方向。

5 总结与展望

利用乳酸菌合成γ-氨基丁酸是一种经济、安全、环保生产高附加值天然活性物质的重要手段。具有合成GABA能力的乳酸菌种类较多且合成能力具有种属差异，因此从食品中或与食品相关环境中筛选高产GABA的乳酸菌是研究产GABA乳酸菌性质和开发相关产品的基础。乳酸菌合成GABA的影响因素有很多，其中一些因素还会相互作用、综合影响GABA的终产量。

谷氨酸脱羧酶的活性与GABA产量密切相关，目前对乳酸菌GABA产量的优化主要从优化该酶活性入手，与之相关的影响因素研究的也比较透彻。但与GABA代谢相关的酶除谷氨酸脱羧酶还有GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶等[38]，因此找到影响其他关键酶活性的因素并研究这些因素是否影响乳酸菌产GABA的能力对理解和分析乳酸菌GABA的整体代谢途径至关重要，同时也有助于构建乳酸菌中GABA合成与分解的代谢通路。

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