马广友 李俊杰 邵珠福

(辽宁医学院附属第一医院普外科，辽宁 锦州 121001)

大肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，其发病率和死亡率在全球范围内呈逐年上升趋势〔1〕。在我国，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，大肠癌尤其是结肠癌的发病率迅速上升，仅次于胃癌和食管癌，发病年龄趋于老龄化〔2〕。近年来，化疗在大肠癌患者术后复发、转移及晚期转移性大肠癌等患者的治疗中收到较好的治疗效果〔3〕，可以明显延长患者的生存期，提高患者的生活质量，改善预后，其中奥沙利铂在大肠癌的化疗中有较大优势。然而，肿瘤耐药常使患者术后化疗失败。大肠癌的化疗耐药涉及多个方面，其中细胞对药物诱导凋亡耐受及凋亡阈值增高是大肠癌耐药的主要机制之一〔4〕。因此，如何恢复大肠癌对化疗药物诱导的凋亡途径的敏感性成为大肠癌耐药研究的焦点问题。本研究旨在通过检测凋亡抑制蛋白Survivin、Livin、p53及Bcl-2在大肠癌组织中的表达，探讨其与化疗药物奥沙利铂化疗敏感性的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2011年4月至2012年3月辽宁医学院附属第一医院经手术病理证实的74例大肠癌患者，其中男性49例，女性25例；年龄35～81岁，平均(62.2±3.7)岁；结肠癌31例，直肠癌43例。所有患者术前均未行任何治疗。术中取约1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的新鲜肿瘤组织，放入含100 U/ml青霉素+200 μg/ml链霉素的培养液中培养。同时取20例经病理证实无肿瘤残留的组织切缘作为正常对照组。

1.2免疫组化检查凋亡相关蛋白Survivin、Livin、p53、Bcl-2的表达 每例患者术中切除的肿瘤标本用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋后行4 μm连续切片，行免疫组化SP法检测病灶Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表达情况。采用鼠抗人Survivin、Livin、p53、Bcl-2单克隆抗体，购自Imgenex公司(Livin)及Santa Cruz公司(Survivin、p53、Bcl-2)，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。以PBS代替一抗作为阴性对照、已知阳性切片作为阳性对照。

所有病理切片由2名病理科医师在未知患者情况的前提下阅片，每张切片取5个400倍视野观察，每个视野计数100个细胞，记录阳性细胞数。Survivin、Bcl-2以细胞膜或细胞质染色为阳性，Livin以细胞质及细胞核染色为阳性，p53以细胞核染色为阳性，并按照细胞着色强度和阳性细胞率进行计分：无着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0、1、2、3分；阳性细胞≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别记为0、1、2、3、4分。以两者评分相加判断蛋白表达强度：0～1分(-)，2～3分(+)，4～5分()，6分以上()；≤3分为弱表达，≥4分为强表达〔5〕。

1.3肿瘤细胞对奥沙利铂化疗的敏感性检测 将肿瘤组织研磨分散，用0.25%胰酶消化后，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，以细胞分离器调整细胞浓度至5×105个/ml，将奥沙利铂(江苏恒瑞医药公司)以无菌生理盐水配成血药峰值浓度142 μg/ml〔6〕。给药组设6个复孔，同时以PBS溶液作为空白对照。以96孔板接种肿瘤细胞200 μl/孔，振荡混匀后放入37℃、5% CO2培养箱中孵育48 h，然后加入5 mg/ml MTT继续培养4 h，再加入DMSO 100 μl/孔振荡混匀溶解结晶，在酶标仪上于570 nm波长处测定各空的光密度值，并计算肿瘤细胞抑制率：肿瘤细胞抑制率=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100%。

2 结 果

2.1大肠癌组织Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表达情况 大肠癌组Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白强阳性表达率分别有58例(78.38%)、57例(77.03%)、41例(55.41%)、26例(35.14%)。而正常对照组织中仅1例表达Survivin、2例表达Livin、1例表达Bcl-2，且均为弱阳性表达。大肠癌组织与正常对照组织Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白表达率比较，差异均有统计学意义(χ2=4.53、3.81、3.62、2.55，P<0.01)。

2.2大肠癌组织Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表达的相关性 Spearman相关分析结果显示，大肠癌组织中Survivin与Bcl-2蛋白表达强度呈正相关(r=0.412，P<0.05)，其他蛋白表达强度间均无明显相关性(r=0.126～0.288，P>0.05)。

2.3大肠癌患者Survivin、Livin、p53、Bcl-2蛋白表达与奥沙利铂化疗敏感性的关系 Survivin蛋白强表达组中，奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率(36.3±6.1)%显著高于Survivin蛋白弱表达组〔(22.4±3.5)%，t=3.305，P<0.01〕。Livin蛋白强表达组中，奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率显著低于Livin蛋白弱表达组〔(24.6±4.7)% vs (33.5±5.4)%，t=1.900，P<0.05〕。Bcl-2蛋白强表达组中，奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率显著高于Bcl-2蛋白弱表达组，两者差异有统计学意义〔(34.4±3.9)% vs(27.1±3.2)%，t=2.210，P<0.05〕。p53蛋白强表达组与弱表达组比较，奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制率差异无统计学意义〔(31.7±5.8)% vs (30.6±5.0)%，t=0.063，P>0.05〕。

3 讨 论

大肠癌的发生、发展与细胞凋亡密切相关，而多种凋亡相关蛋白在大肠癌的发生、发展及耐药中发挥重要作用。因此，检测凋亡相关蛋白的表达对于监测大肠癌的治疗效果、转移、复发及耐药尤为重要。Survivin和Livin蛋白均为凋亡抑制蛋白家族中的重要成员，两者在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、黑色素瘤及消化系统肿瘤组织中均呈高表达〔7〕，而在正常组织中呈低表达或不表达。Survivin是已知作用最强的凋亡抑制因子，其在组织中的高表达通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性〔8〕，进一步抑制细胞程序性死亡及化疗药物诱导的细胞凋亡。Livin的抗凋亡作用受到线粒体释放的Caspase活化蛋白Smac的调节〔9〕。Livin还能抑制化疗药物介导的细胞凋亡〔10〕，阻断Livin的表达可以促进白血病细胞的凋亡，并能增强化疗药物的抗癌作用。

本研究结果与黎军和〔11〕的研究结果一致，提示Survivin、Livin、p53及Bcl-2蛋白的高表达可能与大肠癌的发生及发展有关。相关分析结果显示，大肠癌组织中Survivin与Bcl-2蛋白表达强度呈正相关与韩杰等〔12〕报道的结果一致，其可能原因为Survivin在Bcl-2的下游直接抑制Caspase的活性，进而协同阻断细胞凋亡。而Survivin与Livin蛋白表达之间并无明显的相关性，表明Survivin与Livin蛋白可能通过不同的作用机制来抑制肿瘤细胞凋亡。

奥沙利铂对结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞性肺癌等多种肿瘤均有较好的疗效，尤其是对顺铂类耐药的肿瘤具有显著抑制作用，与5-FU联合用于治疗结直肠癌作为一线治疗用药显示出较好的优势〔13，14〕。本研究提示Livin可能与大肠癌患者对奥沙利铂的耐药有关，并在大肠癌患者化疗耐受中起到重要作用。抑制Livin蛋白的表达可以抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡，并可能逆转肿瘤耐药、提高围术期化疗效果，可能成为大肠癌基因治疗的一个新靶点。

总之，凋亡抑制蛋白Survivin、Livin、p53及Bcl-2在大肠癌组织中均呈高表达，Livin蛋白在大肠癌组织中的表达可能与奥沙利铂化疗耐药有关，可以临床选择化疗药物提供指导。

4 参考文献

1Koch M，Antolovic D，Reissfelder C，etal.Leucocyte-depleted blood transfusion is an independent predictor of surgery morbidity in patients undergoing elective colon cancer surgery-a single-center analysis of 531 patients〔J〕.Ann Surgical Oncol，2011；18(5)：1404-11.

2徐锦江.老年大肠癌患者术前生存质量相关因素〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(22)：4437-9.

3Lesterhuis WJ，de Vries IJM，Aarntzen EA,etal.A pilot study on the immunogenicity of dendritic cell vaccination during adjuvant oxaliplatin/capecitabine chemotherapy in colon cancer patients〔J〕.B J Cancer，2010；103(1)：1415-21.

4郑 欣.沉默Survivin基因对大肠癌HCT-8/VCR耐药细胞凋亡及药物敏感性影响的初步研究〔D〕.南方医科大学，2008.

5何春年，徐翠清，赵焕芬，等.在子宫颈上皮内瘤变和鳞癌组织中CyclinE、Rb基因表达的研究〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志，2007；16(3)：330-5.

6华 彬，魏润新，马 莹，等.大肠癌细胞对化疗药物的体外敏感性研究〔J〕.中国药业，2011；20(10)：23-5.

7Lazar I.Livin，a regulator of apoptosis protein，is deregulated in melanoma and serves as an independent prognostic factor-a study of 114 melanoma patients〔J〕.J Clin Oncol，2007；25(18)：21006.

8Zaffaroni N，Pennati M，Daidone MG.Survivin as a target for new anticancer interventions〔J〕.J Cell Mol Med，2005；9(2)：360-72.

9Vucic D，Stennieke HR，Pisabarro MT,etal.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas〔J〕.Curt Biol，2000；10(21)：1359-66.

10Zhang QP，Xiong J，Jin YX,etal.CC chemokine ligand 25 enhances resistance to apoptosis in CD4+T cells from patients with T-cell lineage acute and chronic lymphocytic leukemia by means of Livin activation〔J〕.Cancer Res，2004；64(20)：7579-87.

11黎军和.Survivin、Livin在Ⅱ期大肠癌中的表达及siRNA抑制HT-29中Livin基因表达的研究〔D〕.中山大学，2007.

12韩 杰，赵建辉，檀碧波，等.消化道肿瘤凋亡抑制蛋白表达与体外化疗药物敏感性的关系〔J〕.中华普通外科杂志，2009；24(2)：149-52.

13Maughan TS，Adams RA，Smith CG,etal.Addition of cetuximab to oxaliplatin-based first-line combination chemotherapy for treatment of advanced colorectal cancer：results of the randomized phase 3 MRC COIN trial〔J〕.Lancet，2011；377(9783)：2103-14.

14Andre T，Boni C，Navarro M,etal.Improved overall survival with Oxaliplatin，Fluorouracil，and Leucovorin as adjuvant treatment in stage Ⅱ or Ⅲ colon cancer in the MOSAIC trial〔J〕.J Clin Oncol，2009；27(19)：3109-16.