濮孟辉 金东岭 王 蕾 郑发著 时志民

(邯郸市人民医院外科，河北 邯郸 056001)

已有研究表明〔1〕正常甲状腺和甲状腺癌的细胞内有雌激素受体(ER)α表达，而且对甲状腺癌的发生和发展有促进作用。但对ERβ在肿瘤发展中的作用近来却出现了一些有争议的研究和报道〔2〕。最近发现〔3〕ERβ除了野生型之外有6种剪切变体：ERβ1～ERβ6，他们在某些肿瘤中的表达显示了不同的生物学意义。除了ERβ1系野生型ERβ有较多的报道之外，一般认为ERβ2在肿瘤的发展过程中也有重要影响。前期研究〔4〕表明：在甲状腺组织中ERβ2的表达较之ERβ1对甲状腺滤泡上皮可能具有更为突出的保护作用。本研究旨在探讨甲状腺乳头状腺癌(PTC)组织中ERβ1、ERβ2以及ERα的mRNA表达及其与表皮生长因子受体(HER)-2的关系。

1 材料与方法

1.1研究材料 选取邯郸市中心医院、邯郸市人民医院等2010年3月至2011年2月间手术切除的PTC患者20例，均为女性，年龄(42.4±16.3)岁。术前均未行化疗、放疗及免疫治疗。同时选取癌旁正常甲状腺组织10例，年龄(38.1±8.4)岁。所有病例术后均经病理检查证实诊断。每例标本取材后的标本迅速投入液氮中速冻，然后转存于-70℃的冰箱。

1.2半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测ERβ1、 ERβ2和ERαmRNA的表达 两步法RT-PCR 试剂盒和PCR 试剂购自Promega 公司;实验中所有引物均由上海Sangon公司合成。RT-PCR按Trizolrna(Gibco公司)提取说明书对冰冻保存的甲状腺标本进行总RNA抽提后，1 μg总RNA 用于逆转录合成cDNA，具体操作参照试剂盒说明进行。ERβ1和ERβ2引物序列参照文献〔3，4〕，ERβ1：上游引物为：5′-CGA TGCTTTGGTTTGGGTGAT-3′， 下游引物为：5′-GCCCTCTTTGCTTTTACTGTC-3′；ERβ2：上游引物为：5′-TATTGACT GTTTGCGGCGACT-3′，下游引物为：5′-GGATGTTGATGTTTGACTGCT-3′；ERα上游引物：5′-TGCCAAGGAGACTCGCTA-3′ ，下游引物：5′-TCAACA，ITrCTCCCTCCTC-3′。内参照β-actin正向：5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′，反向：5′-TCATCACCA1vrGGCAATGAG-3′。各取cDNA 3 μl 、ERβ1和ERβ2上下游引物各1 μl 、AMV逆转录酶(20 U/L)1 μl、1.5 mmol/ L MgCl2、1 ×PCR 反应缓冲液、0.2 mmol/L dNTPs 和灭菌水共同组成50 μl 的PCR 反应体系。94℃变性2 min后，按下述循环进行PCR扩增，ERα和β-actin，94℃变性45 s，55～C退火45 s，72～C延伸45 s；ERβ1、ERβ2反应条件:94 ℃45 s、58 ℃30 s、72 ℃1 min，共40 个循环。取10 μl PCR 反应产物行琼脂糖凝胶电泳,结果进行光密度测定：用密度扫描仪(ZEISS全自动图像分析仪，VIDAS数据分析)测定条带的光密度值(A值)，分别用目的基因扩增产物与内参照基因扩增产物光密度比值表示每个样品目的基因的表达水平。

1.3免疫组织化学染色 S-P试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。甲状腺组织石蜡包埋标本中HER-2表达采用S-P免疫组织化学染色，按试剂盒说明操作，用已知HER-2阳性的人乳腺导管浸润癌标本作阳性对照；用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4免疫组织化学染色结果判断 细胞质或细胞核存在棕黄色颗粒即定义为HER-2阳性细胞。表达水平判定：在光镜下观察，将每一张切片中棕黄色阳性细胞数>10%定义为HER-2表达阳性，阳性细胞数≤10%定义HER-2表达阴性。

1.5统计学分析 应用SPSS10.0统计软件进行方差分析和独立样本t检验。

2 结 果

2.1PTC组织中HER-2表达及ERα表达情况 PTC组HER-2阳性表达患者的ERα平均表达水平(n=14，0.582±0.371)明显高于HER-2阴性表达患者(n=6，0.154±0.120)(t=2.728，P=0.013 8)。

2.2PTC组织中ERβ1与HER-2表达的关系 HER-2阳性表达患者的ERβ1平均表达水平(0.192±0.201)低于HER-2阴性表达患者(0.313±0.190)，但无统计学意义(t=1.252，P=0.226 5)。

2.3PTC组织中ERβ2与HER-2 表达的关系 HER-2阳性表达患者的ERβ2平均表达水平(0.118±0.091)明显低于HER-2阴性表达患者(0.371±0.211)(t=3.828，P=0.001 2) 。

3 讨 论

ERα和β亚型在雌激素敏感器官可对恶性肿瘤细胞的增殖发挥不同作用。前期研究〔5〕也曾对ERα在甲状腺不同组织中的表达有初步探讨。有关ERβ的生理病理作用，无论是在经典的雌激素靶组织还是在雌激素非依赖性组织，都存在着一些有争议的问题〔2，3〕。Helguero等〔6〕对乳腺上皮细胞的研究表明，ERα可诱导17-β雌二醇导致的增殖，而ERβ对生长发挥抑制作用。近年来对ERβ在肿瘤发生发展中的作用尚存争议，因为目前发现ERβ至少存在5种亚型(剪切变体)ERβ1～5，它们在肿瘤中的表达显示不同的生物学意义。前期研究〔4，5〕表明ERα对甲状腺滤泡上皮的增生和分化有促进作用，其过度表达与甲状腺癌的发生发展有关系,而ERβ可能对甲状腺滤泡上皮具有保护作用。ERβ1和ERβ2的表达缺失，尤其是ERβ2剪切变体的表达缺失可能使甲状腺滤泡上皮细胞易受女性激素的影响，导致甲状腺滤泡上皮细胞的增生致癌变。生长因子激活的受体酪氨酸激酶传导通路与细胞的增殖关系密切〔7〕，在激素依赖性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。本实验提示PTC患者中ER亚型的表达可能受HER-2 调节。即HER-2，上调ERα和(或)下调ERβ1和ERβ2，促进肿瘤进展。进一步说明在甲状腺组织中保持正常的ERβ2表达水平较之ERβ1对甲状腺滤泡上皮可能具有更突出的保护作用，其表达下调与甲状腺肿瘤的发生、发展和转移有密切关系，并且是一个强有力的预后评估指标，可以为早期诊断、判断预后及指导治疗提供理论依据。

4 参考文献

1Lewy-Trenda I. Estrogen and progesterone receptors in neoplastic and non-neoplastic thyroid lesions〔J〕.Pol J Pathol，2002；53(2):67-72.

2Skliris GP，Munot K，Bell SM,etal.Reduced expression of estrogen receptor beta in invasive breast cancer and its re-expression using DNA methyl transferase inhibitors in a cell line model〔J〕.J Pathol，2003；201(2)：213-20.

3Green CA，Peter MB，Speirs V，etal.The potential role of ER beta isoforms in the clinical management of breast cancer〔J〕.Histopathology，2008；53(4)：374-80.

4金东岭，王 蕾，席 丰，等.甲状腺肿瘤组织中雌激素受体β1和β2的表达及其意义〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2011；27(11)：932-4.

5金东岭，李联祥，刘现军，等.雌激素受体亚型ERα、ERβ和Ki-67在不同甲状腺疾病组织的表达及意义〔J〕.解放军医学杂志，2008；33(9):1109-12.

6Helguero LA，Faulds MH,Gustafsson JA，etal.Estrogen receptors alfa (ERa) and beta (ERβ)differentially regulate proliferation and apoptosis of the normal murine mammary epithelial cell line HC11〔J〕.Oncogene，2005；24(44)：6605-16.

7Rony S，Edwin GK.The MAPK signaling cascade〔J〕.FASEB J，1995；9(9):726-35.