张秀艳 石国刚 刘秀艳 葛红娣

(遵化市人民医院,河北 遵化 064200)

结肠癌5年生存率为62％〔1〕。化疗是治疗晚期结肠癌的主要手段之一〔2〕。研究表明，65％～70％的结直肠肿瘤组织中表皮生长因子受体(EGFR)过表达，EGFR信号途径和晚期结直肠癌的进展和转移有一定关系〔3〕。本文观察埃克替尼诱导结肠癌细胞Caco-2的凋亡及对相关凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8的影响，旨在进一步观察EGFR对结肠癌及其相关影响机制。

1 材料和方法

1.1材料 Caco-2细胞株(购自中国医学科学院基础医学研究所)；培养于含有10％胎牛血清、10 g/L非必需氨基酸、10 g/L谷氨酰胺和青霉素-链霉素双抗液的(DMEM)完全培养基,在37℃、5％ CO2条件下进行培养, 3 d可基本融合。将Caco-2细胞接种于Transwell板上(孔径0.8 μm), 接种密度为1×104/cm2, 隔天换液；胎牛血清(Gibco, 美国)；Transwell培养板(Cornig,美国), GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司)；核转录因子(NF)-κBp65抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖变化，调节Caco-2细胞浓度，以3×103/孔接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，每孔加入 MTT 溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，轻轻吸弃培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，选择490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(OD)值，细胞抑制率=〔(空白对照组 OD 值-各实验组 OD 值)/空白对照组OD值〕× 100％。

1.3结肠癌Caco-2细胞凋亡的检测 收集埃克替尼作用24、48、72 h及空白对照组的细胞 ,调整细胞密度为1×107个/ml,取25 μl的细胞悬液同1 μl的AO/EB染液混匀，吸取10 μl的混合液置于一洁净的载玻片上 ,盖玻片封片后 ,置于荧光显微镜下观察。

1.4Western印迹检测NF-κBp65蛋白水平的表达 收集各组细胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清测定浓度后-80℃保存备用。SDS-PAGE电泳分离，完毕后将蛋白转移到PVDF膜上。……