张艳兰 杜忠东 杨海明 上官文 董 伟 宋铭晶

·论著·

川崎病小鼠肿瘤坏死因子α/核因子κB/基质金属蛋白酶-9通路研究

张艳兰1,2杜忠东1,2杨海明1,2上官文1,2董 伟3宋铭晶3

目的 通过检测川崎病(KD)小鼠TNF-α、核因子-κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达及活性变化，探讨KD的发病机制。方法 3周龄C57BL/6雄性小鼠60只，分为模型组和对照组，每组各30只。模型组单次腹腔注射0.5 mL干酪乳杆菌细胞壁提取物(LCWE)制备KD模型，对照组注射等量生理盐水。检测两组小鼠注射后14、28和56 d时点外周血TNF-α水平，心脏、冠状动脉组织NF-κB、MMP-9及其组织抑制物-1(TIMP-1)表达水平，NF-κB 、MMP-9表达活性。观察小鼠心脏超声改变，同时行病理学检查冠状动脉病变严重程度。结果 ①模型组建模后14 和28 d时点超声心动图显示，冠状动脉血管内膜毛糙，血管壁与血管周围出现高回声，部分呈冠状动脉瘤样扩张改变；②模型组建模后14 和28 d时点病理学检查可见冠状动脉主干周围管壁肿胀、以淋巴细胞为主的大量炎细胞浸润，弹力层显著破坏。模型组建模后14 d时点，血清TNF-α水平明显高于对照组[(389.3±0.3)vs(18.9±0.3)pg·mL-1，P<0.01]；建模后14和28 d时点心脏及冠状动脉NF-κBp65蛋白表达水平模型组均显著高于对照组[14 d：(37.5±9.3)vs(14.6±5.6)μg·L-1,28 d；(57.6±13.7)vs(21.6±6.6)μg·L-1；P均<0.05]；建模后14和28 d时点心脏及冠状动脉MMP-9/TIMP-1水平模型组显著高于对照组[14 d：(4.9±1.7)vs(0.5±0.4)，28 d：(12.3±6.9)vs(0.09±0.1)；P均<0.01]。结论 KD急性期TNF-α等炎性细胞因子分泌，NF-κB活化和MMP-9分泌上调可能是KD心脏及冠状动脉炎症发生的重要通路。

川崎病； 动物模型； 肿瘤坏死因子α； 核因子-κB； 基质金属蛋白酶-9

川崎病(KD)是一种好发于5岁以下儿童、病因未明的全身性血管炎综合征，主要累及中小动脉，特别是冠状动脉。KD的发病机制尚未明确，目前认为与KD发病急性期的免疫系统高度激活导致的血管炎损害有关。有研究显示，KD患儿外周血单核细胞NF-κB的表达较正常组升高，伴有冠状动脉并发症时升高趋势更明显；外周血可观察到MMP-9的异常表达和MMP-9/TIMPs比例失调。提示NF-κB和MMP-9通路可能参与了KD的血管炎症过程，但临床研究取材困难，特别是冠状动脉组织，难以开展进一步的机制研究，且尚未有明确统一的KD动物模型。为此，本研究旨在通过单次腹腔注射干酪乳杆菌细胞壁提取物(LCWE)，诱发小鼠冠状动脉炎症，检测不同时点TNF-α、NF-κB和MMP-9水平，从而为进一步研究KD的发病机制提供新思路。

1 方法

1.1 动物 无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠60只，雄性，3～4周龄，体重(10.5±0.8) g。购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(合格证号：SCXK军2009-0007)，饲养在中国医学科学院动物研究所。研究获得首都医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 材料 干酪乳杆菌菌种由加拿大多伦多大学Yeung RS教授惠赠。乳酸菌MRS肉汤培养基、藻红蛋白标记的大鼠抗小鼠CD34、别藻蓝素标记的大鼠抗小鼠CD45、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠Flk-1(BD公司)；核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、胰蛋白酶、鼠李糖标准品、十二烷基硫酸钠、FITC标记血凝素、噻唑蓝、纤维连结蛋白、基质胶(Sigma公司)；内皮细胞生长培养基-2(lonza公司)；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(Molecular Probes公司)。高分辨小动物超声仪(加拿大VISUALSONIC公司)；高速冰冻离心机、台式离心机(美国Eppendorf公司)；超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；-80℃冰箱(美国Cryostar公司)；光学显微镜 (美国Olympus公司)；细胞培养箱(美国SHELLAB公司)；超净工作台(苏州宏瑞净化科技有限公司)；流式细胞检测仪(美国BD公司)；酶标仪(芬兰Labsystems公司)；切片机(德国Leica公司)。

1.3 制备LCWE 参考Yeung等[1]方法行LCWE提取。①将干酪乳杆菌进行复苏、培养后收集处于对数生长期的酪乳杆菌，4%SDS进行皂化裂解；②充分洗涤SDS后分别加入RNA酶、Trypsin、DNA酶去除菌液中RNA、蛋白质、DNA，并离心收集沉淀物；③将所收集沉淀物超声波破碎2 h，4℃ 10 000 r·min-1离心1 h，取上清液即为LCWE；④硫酸/苯酚比色法测定LCWE含量，以PBS调整浓度为1 mg·mL-1。

1.4 小鼠KD模型的建立 将60只3～4周龄C57BL/6雄性小鼠任意分为模型组和对照组，每组各30只。于实验当天(0 d)模型组腹腔注射0.5 mL LCWE(1 g·L-1)1次，对照组腹腔注射等量PBS液1次。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况 饮食、活动、体重和毛发变化等。

1.5.2 超声心动图检查 于注射LCWE后14、28、56 d时点分别取模型组、对照组10只小鼠麻醉后脱毛，取仰卧位，分别于胸骨旁左室长轴、左室短轴、四腔心切面行超声检测，测量小鼠左冠状动脉内径，采用Vevo770软件进行测量分析。

1.5.3 TNF-α、NF-κBp65、MMP-9检测 于上述3个时点心脏超声后小鼠摘取眼球取血，离心分离血清和血浆采用ELISA方法测定外周血TNF-α含量。之后采用颈椎脱臼法处死小鼠并称重，后解剖取心脏标本并称取心脏重量，将其分别置-20℃保存2 h，后置于-70℃保存。取部分心脏标本置于蛋白保护液中，组织裂解提取总蛋白，采用Western-blotting方法测定心脏及冠状动脉NF-κBp65和MMP-9、TIMP-1蛋白表达水平；采用凝胶迁移或电泳迁移率检测方法测定心脏及冠状动脉NF-κB活性水平；采用明胶酶谱方法测定心脏及冠状动脉MMP-9表达活性。

1.5.4 病理学检查 心脏标本光镜下经苏木精-伊红染色及弹力纤维蛋白染色，观察炎细胞浸润情况及弹力层破坏情况。

2 结果

2.1 一般情况 模型组注射LCWE后1～3 d，小鼠出现寒战，毛发紊乱无光泽，易激惹，纳食、纳水及活动减少，喜抱团，持续3～4 d后逐渐恢复正常，于建模后第52天死亡2只。对照组无类似表现，无死亡。模型组与对照组建模后14、28、56 d时点体重、心脏重量、心脏重量/体重差异均无统计学意义(表1)。

2.2 超声心动图检测 建模后14和28 d时点模型组小鼠超声心动图显示其冠状动脉血管内膜明显毛糙，血管壁与血管周围出现高回声，部分呈冠状动脉瘤样扩张改变(图1A)，左右冠状动脉均可受累，多为左冠状动脉主干近端，左侧冠状动脉内径明显增宽，显著高于对照组[14 d：(0.46±0.11)vs(0.32±0.14) mm；28 d:(0.47±0.09)vs(0.36±0.06) mm]，P<0.01。建模后56 d时点模型组超声心动图显示左冠状动脉内径为(0.43±0.11) mm，较前缩小，部分存在冠状动脉管腔狭窄、血栓形成(图1B、C)，与对照组[(0.38±0.02)mm]比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 病理学检查 建模后14 d时点，模型组小鼠心脏标本冠状动脉主干周围可见到管壁肿胀、以淋巴细胞为主的大量炎细胞浸润(图2A)；28 d时点模型组小鼠冠状动脉炎症细胞浸润消退，冠状动脉增宽、动脉中层平滑肌增生明显(图2B)；建模后56 d时点，模型组小鼠弹力层可见显著破坏，弹力层着色浅淡，失去正常的连续性，同时内膜增生明显(图2C,D)。对照组冠状动脉的主干周围未见明显炎症细胞浸润，弹力层形态自然，能够被连续染色，动脉中层平滑肌未见增生，内膜细胞形态正常(图2E,F)。

Notes: There was no siginificant difference in birth weight, heart weight and heart weight/body weight ratio at different time points after operation between KD group and control group. 1)n=8

图1 模型组不同时点冠状动脉超声心动图表现

Fig 1 Ultrasonographic findings of coronary artery of the model group at different time points

Notes A: Echocardiography of model group on day 28 showed coarsed intima of coronary artery after intraperitoneal injections of LCWE, and local coronary artery aneurysm; B, C: Echocardiography of model group on day 56 showed coarsed intima of coronary artery and high density echo images around the coronary artery wall, and luminal stenosis and thrombosis

2.4 血清TNF-α水平比较 表2显示，建模后14 d时点模型组血清TNF-α水平显著高于对照组，P<0.01；28和56 d时点,模型组血清TNF-α水平较14 d时点呈显著下降趋势,与对照组比较差异无统计学意义，P>0.05。

2.5 心脏及冠状动脉NF-κBp65活性及表达水平检测 表2显示，模型组建模后14 d时点，心脏及冠状动脉NF-κBp65表达含量和蛋白活性明显高于对照组，P<0.01。28 d时点模型组心脏及冠状动脉NF-κBp65表达含量和活性仍显著高于对照组,P<0.01。56 d时点NF-κBp65表达含量和活性较14和28 d时点显著下降，与对照组差异无统计学意义，P>0.05。

2.6 心脏及冠状动脉MMP-9、TIMP-1蛋白表达水平及MMP-9活性检测 表2显示，建模后14和28 d时点，模型组小鼠MMP-9、TIMP-1蛋白水平和MMP-9活性较对照组明显升高，P<0.01；56 d时点模型组MMP-9、TIMP-1蛋白水平和MMP-9活性较14和28 d时点显著下降，与对照组比较差异无统计学意义，P>0.05。建模后14 d时点，MMP-9/TIMP-1比值模型组明显高于对照组，P<0.05。28 d时点MMP-9/TIMP-1水平较14 d时点升高，且显著高于对照组，P<0.01；56 d时点，两组差异无统计学意义。

图2 模型组和对照组不同时点冠状动脉超声心动图表现

Fig 2 Ultrasonographic findings of coronary artery in the model and control groups at different time points

NotesCA: coronary artery, AO: aorta. A:14 days after intraperitoneal injections of LCWE，a large number of inflammatory cell infiltration was identified in the coronary artery trunk and branches(HE dyed,×200); B: 28 days following LCWE injection , the infiltration of inflammatory cell was subsided，and the dilation of coronary artery，the hyperplasia of smooth muscle in the film of coronary artery intima could be observed(HE dyed, ×200); C,D: Broken elastin was observed in the murine model of KD group after intraperitoneal injections of LCWE on day 56, and accompanied by the hyperplasia of coronary artery intima (Elastin stain, ×400); E: No significant inflammatory cell infiltration was detected around coronary artery in normal control group(HE dyed, ×200); F: Elastin of coronary artery in normal control group was continuous, no remarkable destruction was observed

3 讨论

由于KD多数预后良好，患儿的病理标本临床不易获得，应用KD动物模型成为探索其发病机制的重要手段。目前已有的KD动物模型包括：犬、兔、小猪和小鼠，其中犬为自然起病，其余为诱导免疫模型。本研究采用课题组前期建立的小鼠KD模型[2]，对不同阶段KD小鼠模型行超声心动图检查，对其冠状动脉损伤情况进行动态观测和全面评价，并对其心脏标本进行病理观察，结果显示：模型组小鼠急性期(14和28 d时点)冠状动脉血管内膜明显毛糙，部分呈冠状动脉瘤样扩张改变，多为左冠状动脉主干近端，左侧冠状动脉内径增宽；模型组恢复期(56 d时点)超声心动图显示冠状动脉内径值较前缩小，部分存在冠状动脉管腔狭窄、血栓形成。这一结果与KD患儿不同病程的超声心动图检查结果较为一致[3]。模型组小鼠急性期冠状动脉主干周围以淋巴细胞为主的大量炎细胞浸润，恢复期冠状动脉炎症细胞浸润消退，冠状动脉增宽、动脉中层平滑肌增生明显，同时内膜增生明显，其冠状动脉损伤的病理变化与自然病程状态的KD患儿冠状动脉损伤情况十分相似[4～6]，能很好的模拟KD冠状动脉损伤的形成过程。

Notes KD groupvscontrol group, 1)P<0.05, 2)P<0.01, 3) the number of mice in model group was 8

单核/巨噬细胞的异常活跃被认为与血管损害的形成相关。激活的单核/巨噬细胞可分泌TNF-α、IL-10、IL-6和IFN-γ等炎性细胞因子，同时也通过自分泌方式作用于单核/巨噬细胞本身，释放炎性介质加剧炎性反应[7]。疾病早期，动脉壁内即出现明显的水肿和坏死性改变，内皮细胞和外膜炎症最先出现，循环中内皮细胞数明显增加[1，2，8]，很快出现动脉全层的炎症，严重损害动脉的支持系统，减弱血管壁完整性，最终血管壁的各层不能分辨，动脉开始扩张，动脉瘤开始形成。Hui等[9]给野生型C57BL/6小鼠腹腔注入LCWE发现冠状动脉炎症，而TNF-α缺陷的TNFRI-/-、TNFRII-/-小鼠不产生冠状动脉病变；使用TNF-α拮抗剂(etanercept)能保护小鼠不产生冠状动脉病变。提示，TNF-α是LCWE诱导的小鼠冠状动脉炎症发生发展中重要的炎症因子。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类锌、钙离子依赖性的内源性蛋白水解酶家族，在体内主要降解细胞外基质(ECM)，在结缔组织的降解和重建、炎症反应和缺氧缺血损伤等过程中起重要作用[10]。最近研究发现，KD合并冠状动脉病变患儿MMP-2、MMP-9水平显著升高[11]，而血管弹性层的破坏与局部MMP-9/TIMP-1比值持续失衡、MMP-9活性过高有关[12，13]。本研究表明，KD模型小鼠MMP-9含量在建模后14和28 d时点与对照组比较明显增高，TIMP-1的表达随MMP-9的增多而增强，MMP-9/TIMP-1及MMP-9的活性在建模后14和28 d时点较对照组明显升高，28 d时点的差别尤为明显。而在建模后56 d时点，MMP-9含量及活性、MMP-9/TIMP-1明显下降，与对照组间无显著差异。

MMP-9在KD中上调的机制目前尚不清楚。Sakata等[14]发现，经KD患儿血浆或细胞因子处理的脐带内皮细胞有MMP-9 mRNA的表达，认为IL-1β，IL-6,TNF-α可刺激MMP-9的表达。核转录因子-κB(NF-κB)与MMP-9的关系既往多在癌症细胞研究中被报道。Li等[15]认为IL-23可通过活化NF-κB通路上调MMP-9的表达，促进肝细胞癌转移。有研究认为，MMP-9基因启动子位置及TIMP-1基因5′ 调节区域均存在NF-κB结合位点。可使细胞间黏附分子、诱导型一氧化氮合酶、TNF-α、IL-6、IL-lβ及IL-8等炎症反应相关炎症前分子的转录最大化，进而激发MMP-9分泌[16]。Ichiyama等[17]发现KD患儿单核/巨噬细胞内NF-κB活性明显增加，认为NF-κB可能作为始发炎症反应的上游环节在介导血管内皮细胞炎性损伤中起重要作用。本研究结果也显示，模型组小鼠建模后14 d时点，其心脏及冠状动脉NF-κBp65及MMP-9表达含量明显高于对照组，表达含量在建模后28 d时点下降。

综上所述，在KD急性期，TNF-α等炎性细胞因子分泌、NF-κB活化、MMP-9分泌上调，TNF-α/NF-κB/MMP-9可能是KD心脏及冠状动脉炎发生的重要通路，相关的发病机制有待进一步深入研究。

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(本文编辑：丁俊杰)

Experimental study of TNF-α/NF-κB/MMP-9 pathway in a murine model of Kawasaki disease

ZHANG Yan-lan1,2, DU Zhong-dong1,2, YANG Hai-ming1,2,SHANGGUAN Wen1,2, DONG Wei3,SONG Ming-jing3

(1 Department of Cardiology, Beijing Children′s Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045；2 Key laboratory of major diseases in childfren, Ministry of education (Capital Medical University)；3 Animal Research Institute, Chinese Academy of Medical Sciences , Beijing 100021, China)

DU Zhong-dong，E-mail:duzhongdong@126.com

ObjectiveTo detect the changes of tumor necrosis factor α (TNF-α), nuclear factor kappa B (NF-κB) and matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) in acute phase of a murine model of mice with Kawasaki disease, and to investigate the pathogenesis of Kawasaki disease.MethodsLactobacillus casei cell wall extraction (LCWE) was prepared and injected intraperitoneally to 3 weeks old C57BL/6 mice to induce KD. On day 14, 28 and 56, western blotting, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), zymography and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) were used to detect serum TNF-α levels, the expression and activation of NF-κBp65 protein in cardiac tissue and coronary artery, the expression of MMP-9 and their inhibitors in cardiac tissue and coronary artery in murine model of KD. At the same time, coronary artery damage was assessed by echocardiography and pathological detection.ResultsEchocardiography identified that coarsed intima of coronary artery and high density echo images around the coronary artery wall were found after intraperitoneal injections of LCWE, and accompanied by local coronary artery aneurysm. Furthermore, swelling of vessal wall and focal inflammatory infiltrate in the murine model of KD group were identified in the coronary artery trunk and branches. Broken elastin was consistently observed in the murine model of KD group. The serum TNF-α levels in the murine model group of KD (389.3±0.3 pg·mL-1on d14) were significantly higher as compared to control group(18.9±0.3 pg·mL-1on D14) (P<0.01). The expression of NF-κBp65 in the model group(37.5±9.3μg·L-1on d14, 57.6±13.7 μg·L-1on d28) was significantly higher than control group (14.6±5.6 μg·L-1on d14, 21.6±6.6 μg·L-1on d28)on day 14 and day 28 following LCWE injection (allP<0.05). The expressions of MMP-9/TIMP-1 in control group (0.5±0.4 on d14, 0.09±0.1 on d28) were significantly lower than the murine model group of KD(4.9±1.7 on d14, 12.3±6.9 on d28) on day 14 and day 28 after LCWE injection (P<0.01).ConclusionUp-regulation of TNF-α/NF-κB/MMP-9 pathway might be an important mechanism of inflammation of heart and coronary arteritis in the acute phase of KD. Further study is needed to clarify this pathogenesis.

Kawasaki disease; Model; Tumor necrosis factor-α; Nuclear factor kappa-B； Matrix metalloproteinases-9

国家自然科学基金面上项目：81274109、30973238；北京自然科学基金B类/北京教育委员会重大科研项目：KZ201010025024；北京市教育委员会科技创新平台项目：PXM2011_014226_07_000085；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目：2009-3-38

1 首都医科大学附属北京儿童医院心内科 北京，100045；2 教育部儿科重大疾病重点实验室(首都医科大学) 北京，100045；3 中国医学科学院动物研究所 北京，100021

杜忠东，E-mail: duzhongdong@126.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2014.0.013

2013-11-24

2014-01-07)