赵燕梅，张吉明，许庆方

（山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）

Rep-PCR技术及其应用现状

赵燕梅，张吉明，许庆方

（山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）

文章着重介绍了Rep-PCR技术原理、特点及其在细菌、真菌、环境微生物遗传多样性研究方面的应用。Rep-PCR目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类，此方法操作方便，可以大样本进行，且Rep-PCR分辨效果好，可重复性强。现在Rep-PCR可自动化分型，并可建立各种细菌REP、ERIC-PCR分型标准数据库。但Rep-PCR也存在一定问题，不同来源的或不同批次的引物和酶，对Rep-PCR结果都有一定的影响。

Rep-PCR；细菌；真菌；环境微生物；遗传多样性

1 Rep-PCR

细菌基因组重复序列PCR（repetitive extragenic palindromic PCR，Rep-PCR）是由 Versalovic于 1991年描述的一种细菌基因组指纹分析方法。该方法是通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，来揭示基因组间的差异。细菌的重复序列是一类在维护基因组DNA结构和遗传进化方面起重要作用的高度保守的DNA序列，在细菌基因组中广泛分布，约占细菌基因组的5%［1］。在不同种细菌或同种不同菌株中，重复序列单元的数量和在染色体上的分布各具特点。这些序列单元的功能大部分尚未明确，但最新研究表明，它们可能参与RNA或DNA的合成与代谢［2］，也可能与细菌基因组的进化有关［3］。当前，在多态性研究中应用较多的重复序列有（GTG）5序列、REP序列（repetitive extragenic palindromic，REP，35～40 bp）、ERIC序列（enterobaeterial repetitive intergenic consensus，ERIC，124～127 bp） 以 及 BOX序 列（154 bp）等［4-5］。这些重复序列分布在细菌基因组上的不同位点并以不同的距离分隔，存在菌株和种属水平上的差异。如果以细菌的基因组DNA作为模板，这些重复序列作为引物进行PCR，重复序列都是特定的，因此可用来对细菌进行鉴定和多样性研究［6］。Rep-PCR技术的优点主要有：①分辨率高；②实验费用低；③适于高流通量菌株；④对许多革兰氏阴性菌和一些阳性菌的鉴定很可靠；⑤快速、易于操作、重复性好［7］。Rep-PCR目前可以实现自动化，并可建立相应菌种的REP、ERIC-PCR分型数据库，以备比对鉴定之用。Rep-PCR目前主要应用于细菌，其中乳酸菌方面主要集中在双歧杆菌（Bifidobacteri－um）、芽孢杆菌（Sporolactobacillus）、乳杆菌（Lactobacillus）、肠球菌（Enterococcus）等多态性的研究中。

2 Rep-PCR技术原理

Rep-PCR技术的原理是利用特定的引物扩增细菌基因组DNA的重复序列，这些序列在进化过程中高度保守，扩增位于这些序列之间的不同区域可得到不同的图谱，扩增产物经凝胶电泳便可以分析其多态性。

Rep-PCR通常有5种方法用于不同细菌的基因分型。这 5种方法分别为 Rep-PCR，ERIC-PCR，ERIC2-PCR，BOX-PCR，其设计引物长度一般为15～22 bp。REP-PCR引 物 ：Rep1R-I（5′-III ICG ICG ICA TCI GGC-3′）和 Rep2-I（5′-ICG ICTTATCIGGCCTAC-3′）；ERIC-PCR：ERIC1R（5′-ATG TAA GCTCCTGGGGAT TCA C-3′） 和 ERIC2（5′-AAG TAA GTG ACTGGGGTG AGCG-3′）；ERIC2-PCR：ERIC2（5′-AAG TAA GTG ACT GGGGTGAGCG-3′）；BOX-PCR：BOXA1R（5′-CTACGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3′）；（GTG）5-PCR：（GTG）5（5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′）［8］。不同的文献使用的引物可能不一样，除了用Rep1R-I和Rep2-I引物外，还使用了（GTG）5引物对乳杆菌的一些种进行了鉴定，结果发现采用（GTG）5引物得到的多态性更高。PCR产物可用1%～3%的琼脂糖凝胶电泳分析。

3 Rep-PCR应用现状

Rep-PCR技术的分辨率虽没有脉冲凝胶电泳高，但此方法更简单快捷、经济方便，也可提供大的信息量。Rep-PCR方法在微生物分类鉴定、菌株的分型、亲缘关系和分子微生物生态学研究中有着广阔的应用前景。

3.1 Rep-PCR在细菌遗传多样性研究方面的应用

满朝新等［9］采用了Rep-PCR指纹图谱技术，对分离自内蒙古通辽地区的传统发酵乳中的乳酸菌（Lactobacillus）进行了鉴定和多样性分析。发现应用Rep-PCR指纹图谱技术能够对实验菌株达到非常好的分辨能力。实验结果表明，该地区的乳酸菌呈现出非常高的多样性，其中植物乳杆菌（L.plantarum）和瑞士乳杆菌（L.Helveticus）等6种菌种是这些传统发酵乳中常见的菌种，而植物乳杆菌为优势种；而且还发现同一乳酸菌种群指纹图谱存在一些特征性的条带，为快速鉴定乳酸菌提供了理论依据。李洁等［10］对大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、四联球菌（Micrococcus tetragenus）、普通变形杆菌（Proteusvulgaris）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）基因组DNA进行Rep-PCR扩增，并在模板样品中混入植物DNA作对照，结果表明，用Rep-PCR方法分析细菌基因多样性，能在较大范围内避免植物基因的干扰。郑晓丽等［11］采用Rep-PCR技术对分离得到的34株A型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）进行了遗传多样性分析，结果显示，尽管Rep-PCR分型方法只能将34株产气荚膜梭菌分为7个亚型，但是，仍然表现出对产气荚膜梭菌菌株较高的鉴别能力，不失为一种简便、快速、可靠的产气荚膜梭菌分型方法。林海云等［12］运用Rep-PCR技术对84株不同寄主的青枯雷尔氏菌株（ralstonia solanacearum）进行基因多样性研究，基于所扩增出的基因指纹图谱表明，Rep-PCR扩增出20条特异性条带，即Rep-PCR多态性分析技术可为我国青枯雷尔氏菌基因多样性的研究提供另一条途径。李伟伟等［13］应用Rep-PCR方法追踪淮河流域某水库粪便污染的来源。此方法能较好地区分水体中大肠杆菌的不同来源，为水体治理提供了依据。许龙岩等［14］应用Rep-PCR方法对副溶血性弧菌（VibrioParahemolyticus）进行分型研究，结果表明Rep-PCR对此菌具有很好的分型效果。

3.2 Rep-PCR在真菌遗传多样性研究方面的应用

何培新等［15］研究了Rep-PCR技术在平菇（Pleurotus spp.）栽培菌株分类鉴定中的应用。结果表明，Rep-PCR技术对供试平菇菌株扩增出的条带清晰，重复性好，多态性高。周金凤等［16］采用ERIC-PCR技术对19个白灵菇（P.nebrodensis）和杏鲍菇（P.eryngi）的栽培菌株扩增并分析它们之间的亲缘关系，结果表明，ERIC-PCR技术可以很好地区分这两个菌种。Alves等［17］应用BOX-PCR、Rep-PCR、ERIC-PCR技术对葡萄树上分离的病原真菌进行指纹图谱分析，BOX-PCR Rep-PCR和ERIC-PCR显示的条带表明，Rep-PCR分子技术可区分种间差异，也可揭示种内差异。

3.3 Rep-PCR在环境微生物中的应用

吴清平等［18］采用ERIC-PCR技术对来自不同环境的20种菌株进行鉴定，鉴定结果显示每种菌株均有独特的带型，此法在对环境细菌鉴定方面有很大实用价值。钟召兵等［19］采用Rep-PCR方法对鸡舍环境内不同地点分离出的金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）进行基因图谱分析，比较相互间的遗传相关性，为有效控制畜禽疾病的流行提供科学依据。Raiabi等［20］用DiversiLab系统、Rep-PCR技术评价萨旺尼河上的肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）的遗传相似性，建立沙门氏菌（Salmonella）的数据库，可以为日常监测和将来爆发事件的来源追踪提供参考依据。胡婧［21］通过Rep-PCR方法，分析牛舍环境中不同来源的产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli）和沙门氏菌的同源性，为控制与干预产毒素大肠杆菌和沙门氏菌提供依据，也为建立牛场养殖环境的监测管理体系提供理论基础。

4 Rep-PCR存在的问题和展望

Rep-PCR方法在研究细菌分类、细菌亲缘关系和分子微生物生态学方面应用很广泛，它能有效区分细菌种、属及菌株间的差异，并能对新发现的菌株和已知菌株作进一步分析，追踪其污染源。Rep-PCR方法今后将会成为细菌鉴别、细菌分型、细菌亲缘关系和细菌分子遗传分析的有力工具［22］，且此方法快速而简单，对用于大规模流行病学的研究具有可行性［23］。Rep-PCR方法虽应用前景很广阔，但也存在一定问题。Rep-PCR指纹分析技术可以反映出菌株间基因组中存在差异，但该技术不一定能反映出细菌间质粒DNA上的差异；不同来源的或不同批次的引物和酶，对Rep-PCR结果都有一定的影响［24］；样品处理和提取DNA的过程都会影响PCR技术的重复性、准确性和特异性［25］；另外，PCR仪自身的不稳定因素，也可导致PCR反应在扩增时出现偏差和错误。

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Application Statusof Rep-PCR Technology

Zhao Yan-mei，Zhang Ji-ming，Xu Qing-fang
（CollegeofAnimalScienceand Technology，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China）

This paper focuses on the principle，characteristics of Rep-PCR and its applications in bacteria，fungi，environmental microbialgenetic diversity.Rep-PCR hasbeen developed rapidly and applied widely in gene classification ofbacteria，fungi，environmentalmicrobial.Themethod can analyse large samplewith conveniently.Besides，the Rep-PCR has a good resolution and repeatability.Currently，Rep-PCR is available to automatic classification，and establishing classification standard database of REP，ERIC-PCR.But Rep-PCR also has some problems，different sources or different batches of primers and enzymes have a certain influenceon the resultofRep-PCR.

Rep-PCR；bacteria；fungi；environmentalmicrobial；genetic diversity

Q3-3

A

2095-3887（2014）03-0055-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.03.018

2014-02-17

公益性行业（农业）科研专项（201303061）；山西省科技攻关计划（20100311052）；“十二五”国家科技支撑计划（2011BAD17B02）

赵燕梅（1990-），女，硕士研究生。

许庆方。