李小东，郭 庆，高璟英，张 婉，武冬梅，刘云峰，章 毅

老年人是糖尿病高发人群，在全部心脑血管病死亡的病例中，除直接与糖尿病有关外，其余13%的病例与高血糖有关，高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因［1］。近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注，其中有很多胰岛移植的研究。随着分子生物学技术的发展，虽然各个方面取得了很大进步，但其移植效果并不理想，在人体的胰岛移植中，活性能保持一年以上不超过40%［2］。其主要原因是胰岛分离纯化后活性不高，移植后的排斥反应以及免疫抑制剂对大鼠胰岛的毒性作用［3］。因此获得足量、活性良好的胰岛非常重要。本实验采用胶原酶P消化胰腺及Histopaque 1077分离液直接离心分得大鼠胰岛，并对其活性及功能进行评价。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD 大鼠，体重250g～300g，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 试剂 胶原酶P 购自瑞士罗氏公司；双硫棕（DTZ）、HEPES、葡萄糖、多聚赖氨酸（分子量15～30万）购自美国Sigma公司；1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；DispaseⅡ购自美国Amresco公司；青链霉素（双抗）购自北京索莱宝公司；AO－PI购自南京建成生物科技有限公司；大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

1.3 主要仪器 超净工作台（北京世安科技林净化技术有限公司）；CO2细胞培养箱（北京博奥恒信生物科技有限公司）；台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81（日本奥林巴斯IX51）。

1.4 方法

1.4.1 原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养 无菌条件下，大鼠断头处死，迅速打开胸腹，在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住，经胆总管缓慢注入13mL 4 ℃的1mg／mL胶原酶P溶液，38 ℃水浴消化11min，取出立即加入20 mL 4℃培养液（含10%胎牛血清）终止消化，剧烈振摇胰腺至细沙状，用孔径350μm 的滤网过滤，1 200r／min，离心2 min，去上清，加入10 mL 分离液Histopaque 1077至管中重悬组织，将10mL 1640培养基慢慢顺管壁注入管中，3 200r／min，离心23min。收集界面间的悬浮胰岛，在含10%胎牛血清，100U／mL 青霉素，100μg／mL链霉素的1 640 培养基中培养，并置于37℃，5%CO2，100%湿度的孵箱中培养［4］。将胰岛用含3 mmol／L EDTA 的无钙镁PBS溶液脱钙后，加入DispaseⅡ（5mg／mL）酶液，培养箱孵育6min，用4℃培养液终止消化，吹打使胰岛分散，1 000 r／min，离心2min，将胰岛细胞接种在培养皿中，按胰岛培养条件培养［4］。

1.4.2 大鼠胰岛的DTZ 纯度鉴定 DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO，用Hanks液（pH7.8）1∶1 000稀释，0.22μm 孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10 min后镜检［5］；大鼠胰岛的AO／PI活性鉴定：用Hanks液配制储存液，AO：670μmol／L，PI：750μmol／L，4 ℃避光保存，使用前取0.01mL AO 与1mL PI混合，用Hanks液10倍稀释，0.22μm 孔径滤膜过滤，与胰岛混合10min，在荧光显微镜下采用490nm 激发光，510nm 发射光镜检［6］。

1.4.3 胰岛素分泌实验 配置葡萄糖浓度分别是2.8mM，8.3mM，16.7mM 的KRBH 孵育液。方法：①取6个Eppendorf管标号，各加1mL 2.8mM 葡萄糖的KRBH 液，每管挑入5个胰岛，37℃孵育30 min 后，弃上清。②每管再加入1 mL 2.8 mM 葡萄糖的KRBH 液孵育，37℃孵育30 min，收集上清，标号，－20℃保存待测。③依次给予8.3mM 葡萄糖、16.7mM 葡萄糖孵育，方法同上，收集上清，－20℃保存待测。用放射免疫法检测上述待测样品。

1.4.4 激光共聚焦检测细胞内部钙离子浓度 胰岛用Fluo 4－AM（4μM）染料在37℃的条件下孵育半小时，孵育完用含2.8 mM 糖的Hanks液轻轻冲洗两遍，防止染液残留影响之后的细胞内钙离子浓度的测定，再加入2mL 含2.8mM 糖Hanks液。使用奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81观察，设置激光波长494 nm，发射波长516nm。所得到的比值F／F0（细胞荧光减去背景荧光和自身荧光）反应细胞内钙离子浓度的变化［4］。

2 结 果

2.1 原代大鼠胰岛 一般只离体培养7d，在体视显微镜下观察，胰岛质地饱满，呈椭圆形或圆形，透光率较小，直径在100～300μm；胰岛细胞在倒置显微镜下观察呈球形，部分细胞之间相连成细胞团。胰岛中包含α，β，δ和pp细胞，但是在体积上有明显差别，β细胞是α细胞的2～3倍，δ细胞比α细胞更小，β细胞直径11～13.5μm。

2.2 DTZ 和AO／PI对胰岛纯度及活性鉴定 分别在40 倍，100倍的显微镜下观察，可见全部胰岛被DTZ 染成猩红色；在490nm 激发光，510nm 发射光的荧光显微镜下观察，培养过夜的胰岛97%以上可被AO／PI染成绿色。

2.3 胰岛素分泌实验 胰岛分别在葡萄糖浓度为2.8mM（2.8G），8.3mM（8.3G），16.7mM（16.7G）的KRBH 溶液中孵育半小时后，所测胰岛素值分别为：（11.7±1.4）uIU／mL，（38.2±8.7）uIU／mL，（86.3±5.1）uIU／mL，胰岛素分泌量随葡萄糖浓度增加而增加。

2.4 激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度 实验中，在2.8mM 葡萄糖（n＝10）的基础上，8.3mM 葡萄糖（n＝10）可以明显升高胰岛细胞内的钙离子浓度；16.7 mM 葡萄糖（n＝10）在8.3mM 的葡萄糖的基础上进一步的升高了胰岛细胞中的钙离 子 浓 度。2.8Gvs8.3G（P＜0.0 5）；2.8Gvs1 6.7G（P＜0.001）；8.3Gvs 16.7G（P＜0.01）。

3 讨 论

胰岛细胞移植为治疗胰岛素依赖性糖尿病开辟了一条新的途径［7］。胰岛移植不仅可纠正糖代谢紊乱，还能避免因血管病变引起的眼、肾、脑和心血管并发症，但胰岛的分离纯化是一个较复杂的过程，所获胰岛的产量和质量受很多因素影响，稍有偏差即会直接影响治疗效果，因此备受关注［8］。如何获得高纯度及高活性的胰岛仍是亟待解决的问题。

目前成年大鼠胰岛分离纯化多采用机械研磨与Ficoll密度梯度离心法［9］，而本实验采用单一的Histopaque－1077是即用型的，减少了Ficoll不同密度分离剂的配制及除菌的步骤。由于纯化时只有Histopaque－1077和1640培养基两个密度，纯化梯度易于形成，使得胰岛的纯化变得简便，缩短了分离大鼠胰岛的时间。此法减少了多步分离过程中不确定的因素对胰岛质量的影响，尽可能快的给予离体胰岛营养，利于获得纯度高，活性良好的胰岛。Histopaque－1077 较Ficoll等能提供一个更好的渗透环境，能更好地保持胰岛的活性与功能。实验证实，胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离得到的大鼠胰岛纯度高、活性、功能良好。同时我们总结了大鼠胰岛分离纯化过程中一些体会：①胰腺灌注的成功与否是分离纯化胰岛的关键，文献报道多采用4.5号头皮针穿刺灌注，为防止针尖过于锐利，刺破胆管壁致胶原酶外溢，我们采用与此针头同样粗细的细塑料管（尖端较钝）进行灌注。②灌注时用线结扎位置要在最低一支胆管与主干的汇合支以下，以防止部分酶液倒流至肝内。③应采用4℃的胶原酶灌注，因温度高时胶原酶过早消化胰管和腺泡，灌注好的胰腺应置于0℃的冰袋上剔除非胰腺组织，这些非胰腺组织无法消化且会黏附正常胰腺组织，不利于过滤。④胰腺消化分散后，应立即加入20mL 4℃培养液，混匀终止消化。如果培养液用量太少，则不能终止胶原酶的作用，造成过度消化，破坏胰岛完整性，影响分离效果［10］。

DTZ是一种螯合锌、铜、铅等的指示剂，因为大鼠的胰岛β细胞含锌，DTZ染液可将胰岛染成猩红色，所以DTZ对胰岛是特异性染色［5］；AO 为浸润性染料（膜通透性），可侵入活细胞与双链DNA 结合发出绿色荧光；PI为排斥性染料（膜不通透性），不能进入活细胞，与死亡（膜通透性改变）细胞的核酸结合，发出红色荧光［6］。实验中，所有胰岛可被染成猩红色，表明用此种实验方法分得的胰岛纯度较高；AO／PI可将97%以上胰岛染成绿色，表明胰岛活性良好。葡萄糖依赖性的胰岛素分泌实验证实了胰岛功能良好。胰岛细胞中钙离子浓度会升高会促进胰岛素分泌。我们对胰岛细胞中钙离子浓度进行检测后发现，利用高浓度葡萄糖刺激胰岛时，可明显升高胰岛中钙离子浓度。利用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心纯化胰岛是一种较简单可靠的方法。

［1］ Zhao YQ，Lian YY，Li GF，et al.Influential factors for short－term prognosis of patients with acute cerebral infarction：A logistic regression analysis［J］.Medical，2011，36（3）：265－268.

［2］ Bretzel RG，Hering BJ，Schultz AO，et al.International islet transplant registry report［M］.1996－1997.Springer，1996，153－60.

［3］ 杨永生，孙宝震，解英俊，等.大鼠胰岛分离纯化方法的改进［J］.中国实验诊断学，2006，10（12）：1486－1488.

［4］ Zhang Y，Liu Y，Qu J，et al.Functional characterization of hyperpolarization－activated cyclic nucleotide－gated channels in rat pancreaticβcells［J］.，2009，203（1）：45－53.

［5］ Latif Z，Noel J，Alejandro R.A simple method of staining fresh and cultured islets［J］.Transplantation，1988，45（4）：827.

［6］ Lee DY，Yang K，Lee S，et al.Optimization of monomethoxy‐polyethylene glycol grafting on the pancreatic islet capsules［J］.2002，62（3）：372－377.

［7］ 张鑫，高居忠，王学明，等.成年大鼠胰岛分离纯化的实验研究［J］.首都医科大学学报，2003，24（3）：314－316.

［8］ Oneil JJ，Stegemann JP，Nicholson DT，et al.The isolation and function of porcine islets from market weight pigs［J］.Cell Transplantation，2001，10（3）：235－246.

［9］ Brandhorst D，Brandhorst H，Hering BJ，et al.Islet isolation from the pancreas of large mammals and humans：10years of experience［J］.Experimental Clinical Endocrinology ＆Diabetes，2009，103（S 02）：3－14.

［10］ 李永翔，李戈，董维平，等.大鼠胰岛分离纯化技术的改进［J］.复旦学报：医学版，2006，33（2）：266－8.