张瀚尹，梁高峰，2，韦 芳，闫 彬

（1河南科技大学医学技术与工程学院，河南洛阳 471003；2东南大学医学院，江苏 南京 210009）

·综述·

PLGA纳米颗粒作为基因递送载体的研究进展

张瀚尹1，梁高峰1，2，韦 芳1，闫 彬1

（1河南科技大学医学技术与工程学院，河南洛阳 471003；2东南大学医学院，江苏 南京 210009）

寻找安全、高效的基因递送载体一直是基因治疗领域的研究热点之一.本文对近年来 PLGA作为递送载体及相关问题进行了综述.首先简述了 PLGA纳米颗粒的性质及制备方法，然后对其作为递送载体的研究概况进行了探讨，最后指出了目前 PLGA作为递送材料存在的问题，并对其前景进行了展望.

基因递送；PLGA纳米颗粒；基因

0 引言

目前，基因疗法已经逐渐成为临床治疗中的一种重要手段，作为基因治疗的一个关键环节，基因的递送近年来备受关注.其方式有病毒载体法和非病毒载体法两大类.病毒载体法转染率高，使用范围广，但制备较复杂，有一定的毒性，可能产生免疫反应和排斥反应［1－2］.由于这些缺点，限制了其在生物医学中的应用.非病毒载体法转染率虽然不及病毒载体，但是其安全性高、毒性低、不易产生免疫反应和排斥反应，相对而言具有更大的优势.基因递送技术目前已成为生物医学研究中一项重要且常用的技术，运用该技术可以进行外源基因的高效表达、蛋白结构与功能的研究以及生产目的蛋白；基因表达调控机制的研究，实现细胞的表型改变或转化；基因治疗与转基因动物的研究；RNA干扰以及核酸类药物的研究等.

理想的基因递送载体应满足以下几个方面的要求［3］：①保护基因不被破坏和降解；②容易和靶细胞结合；③容易穿过细胞膜；④容易与基因解离；⑤载体本身容易被降解；⑥载体和降解后的产物对机体无毒副作用.

PLGA因其无毒、可降解、易于制备和功能化等方面的良好性能，成为一种较好的基因递送材料［4－6］，PLGA即聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA），是由乳酸和羟基乙酸聚合成，它水解后的产物为乳酸和羟基乙酸，是一种生物相容性好、易生物降解且广泛用于生物医药和生物工程的高分子材料［7－8］.人体正常代谢时也会产生这两种物质，因此PLGA本身是无毒的，不会对机体造成毒副作用.根据实际应用和研究表明，小分子量的PLGA更适合作为基因递送载体，本文主要介绍PLGA纳米颗粒作为基因递送载体的研究进展.

1 PLGA纳米颗粒的制备方法

PLGA纳米颗粒的制备方法有很多种，包括乳化溶剂 挥 发 法［9］、复 乳 化溶 剂 扩散 法［10］、喷雾 干 燥法［11］、复乳化溶剂挥发法［12］等.复乳化溶剂挥发法是最常用于制备基因片段包裹 PLGA的方法.而这些方法的选择取决于所需要的颗粒直径和包裹率.以聚合物为原料制备微球最常用的方法是先制备成O／W、W／O、W／O／W、O／W／O等型乳液后，再根据具体的用途选择适当方法使液滴固化成微球.制备方法的选择对颗粒直径有很大的影响.此外，制备过程中，有机相与水相的比例、PLGA的性质、表面活化剂的选择、pH值、搅拌的方式等均会对纳米颗粒的粒径产 生影 响［12－14］.

1.1 乳化溶剂挥发法 称取一定量的 PLGA固体，溶解于丙酮溶液中，将所得 PLGA溶液用针头以一定的流速滴加到1%吐温 －80乳化剂水溶液中，同时以一定速度搅拌并超声.完成并形成乳液后，于磁力搅拌器上搅拌，当有机溶剂完全挥发后得到纳米粒混悬液.将所得纳米粒混悬液于3 000 r／min低速离心，先除去大颗粒沉淀，再在10 000 r／min高速下冷冻离心1 h，用蒸馏水洗涤沉淀.将沉淀物超声分散于50 mL蒸馏水中，真空冷冻干燥 24 h即可得到 PLGA纳米颗粒.

1.2 复乳化溶剂扩散法 ①称取30 mg的PLGA固体溶于2 mL二氯甲烷中，置于冰上；②量取2%的PVA水溶液 30 mL，置于冰上；③将溶液①冰浴超声30 s，形成初级乳化液，随后将初乳倒入到溶液②中以同样的条件超声2 min，得到复乳；④将复乳在通风橱中，1 000 r／min置于恒温磁力搅拌器上搅拌 3 h，充分挥发二氯甲烷；10 000 r／min，5 min，离心洗涤纳米颗粒3次；将洗涤好的纳米颗粒放入冻存管中真空冻干，保存于 －20℃备用.

1.3 喷雾干燥法 将 PLGA先制备成乳液后，用输送泵把乳液从直径约0.5 mm的喷嘴送出，在压缩空气流速为20 L／min，喷料速度 500 mL／h的流动条件下雾化，压缩空气将 PLGA雾化成极小的液滴，液滴与热空气被共同吹入一个腔体中，并利用吹入的120℃空气瞬时加热，使液滴瞬间除去大部分水分，液滴中的溶剂挥发，并通过废气管排出，干燥的 PLGA纳米颗粒于收集瓶中收集.

1.4 复乳化溶剂挥发法 将一定量需制备的样品溶于5%PEG水溶液中，将一定量 PLGA溶于二氯甲烷／丙酮（体积比3∶1）混合溶液中，再将样品的PEG水溶液加入 PLGA溶液中超声 1 min，形成 W／O型乳液，将该乳液加入一定浓度的PVA水溶液中，冰浴并以一半功率超声10 min，形成复乳液.将该复乳液置于常温下磁力搅拌 3 h，然后在4℃，20 000 r／min低温高速离心20 min收集纳米粒，使用蒸馏水洗涤纳米粒三次，冷冻干燥48 h，可得到 PLGA纳米颗粒.

2 作为递送载体的研究

2.1 递送小分子药物 目前的药物治疗中，药物的分子大小会影响到体内各种酶对其的降解作用，也会使其不能很好地参与到血液循环之中，因而不能发挥应有的疗效.但如果采用一种靶向给药系统，这就会使药物定向地到达靶组织，从而更好地发挥药效.许多研究表明，对于顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、姜黄素等小分子治疗药物，PLGA纳米颗粒可以有效地包裹，并使其发挥更好的作用.Danhier等［15］以偶联了具有肿瘤靶向性的 RGD分子（一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的短肽）的 PLGA纳米微球作为紫杉醇（PTX）的递送载体，研究了它对小鼠肿瘤的生长抑制作用.结果表明，注射了RGD-PLGA-PTX的实验组经过18天肿瘤直径达18 mm，注射PLGA-PTX组用了12 d，而仅注射磷酸缓冲液的对照组只用了 7 d肿瘤直径即达 18 mm.这些实验说明 RGD-PLGAPTX在抑制肿瘤生长上具有显著的效应.此外，我国学者李井泉等［16］在用 PLGA-5-Fu的进一步研究发现，随着给药剂量的增加，纳米颗粒的抑制作用逐渐加强，呈剂量效应.这些研究均为 PLGA纳米颗粒此后更广泛地用于生物医学领域递送小分子药物奠定了理论依据.

2.2 递送 siRNA 目前某些基因异常相关的疾病，尤其是恶性肿瘤的基因治疗日益成为临床上研究的热点.而在这一领域中，RNA干扰以其高效的序列特异性基因沉默技术而得到了广泛关注［17］.作为潜在的治疗药物，其在抗病毒、抗肿瘤和神经系统疾病防治等方面具有巨大潜力［18－19］.但是，同很多生物大分子药物一样，低毒高效的递送方式是 siRNA药物进入临床研究的关键环节，因此该技术的应用重点就转化到了如何开发一种高效的递送载体上.Park等［20］通过 PLGA纳米颗粒包裹的 COX-2 siRNA和地塞米松实现了风湿性关节的有效治疗，结果表明，PLGA纳米粒子可帮助siRNA有效逃避溶酶体的降解作用，并且PLGA无免疫原性，不会引起机体的免疫排斥反应.Zhou等［21］采用偶联特异性肽链的 PLGA包裹的 siRNA在动物体内实现了靶向肺部的高效siRNA的递送，有效的延长了siRNA在体内的循环时间，提高了治疗的效果.实验结果证实，经过特异性抗体或受体修饰的 PLGA／siRNA体系具有更好的治疗效果，而且用药量更少，有望成为一种高效的肿瘤治疗药物.

2.3 递送 pDNA 非病毒载体基因疫苗是指使用非病毒递送载体将治疗基因表达载体 质粒基因（plasmid DNA，pDNA）递送入细胞内，从而使质粒调控基因表达，进而使表达产物发挥治疗作用.Liang等［22］采用复乳化挥发法制备了携带miRNA表达载体的PLGA纳米颗粒，该纳米粒子具有较高的基因转染效率、较低的细胞毒性，在HePG2细胞中获得了较高的miRNA的表达，有效的抑制了HepG2细胞周期的进程.在当前药剂学的研究课题中，将裸 DNA直接注入病变组织，而不依赖于其他物质的参与，这一方法固然简便，无毒无害，但由于裸 DNA直接暴露于血清之中，易受到各种酶的作用，因此转染效率低，作用不稳定.这样，寻找一种高效的基因载体就显得极为重要.PLGA纳米颗粒可运载不同大小的基因片段，可以抵抗核酸酶的降解作用，从而延缓基因降解，并且还能以内吞、融合、脂交换等多种作用方式进入细胞，这就使得PLGA纳米颗粒在 pDNA的导入中具有极大的应用空间，同时，PLGA纳米颗粒载体还克服了病毒载体的安全性问题，这一点至关重要.

2.4 体内应用研究 PLGA纳米颗粒作为一种非病毒载体，相较病毒载体更有优势，因其安全、可持续性释放及良好的生物相容性、可降解性、稳定性等生物学特性，被认为是一种更有前景的基因递送载体.目前在临床医学研究方面已有广泛应用，包括疫苗、组织修复、抗肿瘤等，特别在肿瘤治疗中展现出巨大潜力.对于抗肿瘤研究，孙国臣［23］合成 BCNU-PLGA纳米颗粒，用于观察其对大鼠脑C6质瘤的治疗作用，结果发现该药物表现出显著的抗肿瘤增值、侵袭和抗血管生成作用.刘杰等［24］用体外培养的肝癌细胞系HepG2的细胞分别与采用特殊工艺方法制备的阿霉素PLGA纳米颗粒（ADM-PLGA-NP）及ADM原药共同培养一段时间，以研究 ADM原药和载药纳米颗粒（ADM-PLGA-NP）在治疗肝癌上的差异.结果显ADM-PLGA-NP在细胞内具有更强的 ADM药物分子荧光强度，且稳定性好，易于被 HepG2细胞吞噬摄取，从而使ADM能从纳米颗粒中缓慢释放出来，已达到长期给药的目的，从而更有效地抑制肝癌细胞的生长.

另外，在很多动物实验研究中，发现PLGA在神经再生、血管修复、治疗压力性尿失禁、骨愈合、局部麻醉、防辐射等方面也有显著作用.田洪居等［25］通过向小鼠坐骨神经旁注射罗哌卡因PLGA纳米颗粒（ROP-PLGA-MS），以研究该纳米颗粒的局麻效果.结果显示小鼠在罗哌卡因 PLGA微球坐骨神经旁植入后3 h，给药侧肢体开始出现明显的感觉阻滞效果，较对照侧对热伤害刺激的反应明显迟钝，10～18 h达到药效高峰，30 h起药效开始减退；48 h后药效接近消退，神经阻滞时间约30 h.结果发现ROP-PLGAMS纳米颗粒能有效延长罗哌卡因时效，且血药浓度低，毒性小.这对临床局麻药物研究方面产生了深远影响.孙伟光等［26］制成氨磷汀纳米颗粒用于防辐射，该纳米颗粒能对各个组织器官实行有效的防护，大大降低了辐射造成的损伤.氨磷汀纳米颗粒制剂解决了一直以来氨磷汀类药物口服无效的问题，在防辐射方面具有较好发展前景.孙阳等［27］自制 s-PLGA，通过兔子实验，研究其对兔肝癌的成像效果，结果表明该纳米颗粒能有效增强兔肝脏肿瘤与正常组织间的信号强度对比，对肝癌的早期诊断和治疗具有重要临床意义.此外，在组织工程方面，Kim等［28］将SOX9基因通过 PLGA纳米粒子递送至人骨髓间充质干细胞内，有效的增强了SOX9基因的表达，显著提高了间充质干细胞在体内形成软骨的能力，开辟了干细胞应用于临床治疗的新途径.

3 问题与展望

病毒感染法虽然具有很高的转染效率，但存在潜在、未知的危险性，使其应用受到诸多限制.因此，在基因递送载体和方法的研究中，人们越来越重视非病毒载体和方法的开发与优化.大量的实验研究证实：作为良好的基因递送载体，PLGA纳米颗粒为基因治疗开创了一条全新的途径，特别是作为药物载体与靶向技术的联合运用，在今后必将成为医药界学者研究的热点.现在国外已有 PLGA纳米颗粒上市，国内也正在进行这类生物载体的相关研究，但是还存在着一些瓶颈，例如递送的效率、靶向性、安全性等.这些问题都需要生物医学研究者和临床医师们不断进行深入的研究，并予以解决.

此外，不仅仅是作为递送载体，在组织工程方面，PLGA还可以用于细胞的生长支架，为细胞的增殖提供三维空间和新陈代谢的微环境，并可以决定新生组织的大小、器官的大小和形状.而 PLGA的无免疫原性、组织相容性好和无毒可降解的特性，在体外能够支持细胞的生长、引导体内组织生长、帮助生物活性分子转导以及其组成和结构可以通过剪裁来适应特殊的需要，从而可以提高细胞的生长效率.

当然，基于 PLGA的众多特殊性质，还可以用于皮肤移植，伤口缝合，体内植入等方面，而更多的应用领域还有待于进一步拓展和研究.相信随着科学技术的不断发展，经过不断改性和特异性表面修饰的PLGA纳米颗粒将会越来越完善，并在科学研究和临床治疗中发挥更大的作用.

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Advance research on PLGA nanoparticles as gene delivery carriers

ZHANG Han-Yin1，LIANG Gao-Feng1，2，WEI Fang1，YAN Bin11School of Medical Technology and Engineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；2Medical School，Southeast University，Nanjing 210009，China

To explore safe and efficient gene delivery carriers is of the hot topic in the field of gene therapy.In this paper，research progress on PLGA nanoparticles as gene delivery carriers in the recent years were reviewed.We described the present research status in PLGA nanoparticles and their preparation method.Discussion in-depth for the application of PLGA nanoparticles in biomedical research was also given in the article.Meanwhile，problems existing in PLGA nanoparticles as a delivery carriers were pointed out while its prospect was also proposed.

gene delivery；PLGA nanoparticles；gene therapy

Q782

A

2095-6894（2014）06-155-04

2014-09-18；接受日期：2014-09-30

国家自然科学基金（U1404824）；河南科技大学博士启动基金（09001635）；河南科技大学青年科学基金（2013QN44）；河南科技大学SRTP项目（2012214）

张瀚尹.在读硕士.E-mail：drf1000＠163.com

梁高峰.博士，副教授.E-mail：lgfeng990448＠163.com