■王安忠 路丽芹 李鹏飞 秦建华 马玉忠

（河北农业大学动物医学院，河北保定 071001）

脂肪肝是奶牛的常见疾病，会导致产奶量下降，并伴发多种疾病，给奶牛业造成巨大的经济损失[1,2]。近年来，奶牛的脂肪肝发病率成逐年上升趋势，越来越受到人们的重视。有关研究表明，脂肪肝的形成与细胞色素酶P450（CYP450）有关。CYP450主要位于肝脏内，是肝脏微粒体氧化酶系的主要代谢酶，在肝脏的代谢中起着重要的作用。传统中药丹参能明显抑制肝细胞的脂质过氧化反应，诱导CYP450合成，改善肝脏脂变程度[3]。

目前国内外对脂肪肝的发病机制进行了大量的研究，但不够深入[4-5]。本试验在总结前人经验和研究的基础上，采用胶原酶两步灌流法分离培养奶牛肝细胞，用DL-乙硫氨酸诱导肝细胞脂肪变性模型，用丹参处理脂肪变性的肝细胞，来探讨核因子NF-κB和CYP450在奶牛脂肪肝形成中的作用，为临床上奶牛脂肪肝的中药防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要药品及试剂

DL-乙硫氨酸（Alfa Aesar），Williams E培养基和Hanks（Sigma），胶原酶Ⅰ（Invitrogen），FBS（杭州四季青公司），油红O(上海化学试剂公司)，ALT、AST、SOD、MDA、TG、牛TNF-α ELISA等试剂盒（中生北控公司）、CYP450抗体（ADL）、p-NF-κB p65抗体（Santa Cruz）、碱磷酶标记IgG（北京中杉金桥公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 奶牛肝细胞的分离培养

胶原酶两步灌流法分离肝细胞。先用含0.5 mM EGTA的Hanks液漂洗肝脏5 min，再用150 U/ml胶原酶Ⅰ消化8 min，最后用Hanks液漂洗5 min后分离肝细胞。肝细胞悬浮于Williams E培养基（含0.1 μM地塞米松，1×ITS，10%FBS）中，37 ℃/5%CO2条件下培养。

1.2.2 奶牛脂肪肝体外造模剂量的筛选

肝细胞接种于96孔板（104/孔），不同浓度的DL-乙硫氨酸处理24、48 h后，加入5 g/l MTT 20 μl，4 h后终止培养，弃上清，加DMSO 150 μl，缓慢振荡10 min，570 nm波长处测其吸光度，并计算细胞成活率。……