刘鹏飞，崔春萍，门同义

(1山东省医学科学院，济南250021;2济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院;3军事医学科学院放射与辐射医学研究所;4山东省千佛山医院)

近20年来肾细胞癌的发病率和病死率不断升高［1，2］，已经成为男性中第 7、女性中第 8 位的常见癌症。研究证实，缺氧诱导因子(HIF)在肾癌的发生中起重要作用，其作为转录因子参与血管生成、肿瘤细胞的增殖、细胞的迁移等过程［3］。HIF由一个α 亚基(HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α)和一个 β 亚基组成。β亚基作为结构单位稳定存在，而α亚基作为功能单位很不稳定，只有在低氧环境中存在;最近的研究表明HIF-2α在肾细胞癌的致癌中起重要作用。为研究HIF-2α表达对下游靶基因、细胞生物学特征和致癌能力的影响，我们构建了带绿色荧光蛋白(GFP)并稳定干涉 HIF-2α的 PLKO.1-shHIF-2α的慢病毒载体，并对所得产物进行了鉴定。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 2×Taq PCR MasterMix试剂购于北京庄盟生物公司，凝胶回收试剂盒购于 Promega公司;DH5α大肠杆菌感受态细胞购自北京天根生物科技公司;大剂量质粒提取试剂盒购自Vigorous公司;小剂量质粒提取试剂购自威格拉斯公司。限制性内切酶 BamHl HF 、Spel HF、Agel、EcoRl和 T4 DNA 快速连接试剂盒购自NEB公司。人786-0细胞购于中国科学院上海细胞库，质粒 PCDH、PLKO.1-puro、pMD2G，pSAX2及293FT细胞均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所保存。引物设计:HIF-2α干涉片段上下游引物分别为:5'-CAACCTGCAGCCTCAGTGTATC-3'和5'-CACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3'。根据NCBI提供的PLKO.1-puro病毒包装构建手册合成包装慢病毒的片段(北京奥克生物技术公司合成)，序列如下:5'-CCGGCAACCTGCAGCCTCAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTTCTTCTCGATTTTTTG-3'和5'-AATTCAAAAACAACCTGCAGCCTCAGTGTATCCTCGAGCACCACGTCGTTCTTCTCGAT-3'。以质粒PCDH为模板，设计EF1-EGFP片段上下游引物……