郭玉莲，宋伟丰，李明，黄春艳，王宇，黄元炬

（1.黑龙江省农业科学院植物保护研究所，哈尔滨 150086；2.黑龙江省农业科学院农药应用研究中心，哈尔滨 150086）

不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性差异

郭玉莲1，宋伟丰2，李明2，黄春艳1，王宇1，黄元炬1

（1.黑龙江省农业科学院植物保护研究所，哈尔滨 150086；2.黑龙江省农业科学院农药应用研究中心，哈尔滨 150086）

为评价氟磺胺草醚对玉米的安全性，采用室内毒土法和酶活力测定法探讨不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性差异及其机制。不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性有较大差异，其中，东农888对氟磺胺草醚最敏感，IC50为0.59 mg·kg-1，其次为垦粘1号，耐药倍数仅为1.10；龙467、高油186、龙单38等8个品种的敏感性中等，耐药倍数为2.88～5.25；吉单27、先玉335等6个品种表现出较强的耐药性，耐药倍数为5.71～8.83，其中，吉单27、先玉335和东农888、垦粘1号对氟磺胺草醚敏感性差异显著。氟磺胺草醚对4种玉米的PPO活性、叶绿素含量及光合速率影响均随残留量增加而逐渐增大，氟磺胺草醚对玉米PPO活性、叶绿素含量及光合速率的抑制与品种的耐药性呈负相关。研究表明，不同玉米品种对氟磺胺草醚产生的敏感性差异源于PPO活性差异。

氟磺胺草醚；玉米；敏感性；PPO；叶绿素；光合速率

氟磺胺草醚（Fomesafen）是由英国捷利康公司开发的二苯醚类除草剂[1]，是一种具有高度选择性的大豆、花生田苗后除草剂，能有效防除大豆、花生田阔叶杂草和香附子，对禾本科杂草也有一定防效。能被杂草根叶吸收，使其迅速枯黄死亡，是我国北方豆田苗后应用的主要除草剂品种。氟磺胺草醚是一种原卟啉原氧化酶（Protopor⁃phyrinogen oxidase）抑制剂，这种酶与植物细胞内线粒体和叶绿体缔合，催化原卟啉原Ⅸ氧化为血红素与叶绿素生物合成中的最后一种中间产物——原卟啉Ⅸ。由于原卟啉原氧化酶受抑制，造成原卟啉原Ⅸ大量累积，积累的原卟啉原Ⅸ从质体中泄漏出来，在细胞质中转化为原卟啉Ⅸ[2-5]，在光和分子氧存在条件下，原卟啉Ⅸ产生单态氧，导致脂质过氧化和膜损伤[6]。药液接触作物叶片后，破坏叶绿素合成，导致植物叶片细胞坏死。氟磺胺草醚在土壤中的半衰期有的可长达100 d以上[7]，残留在土壤中的氟磺胺草醚易对后茬水稻、马铃薯、甜菜、玉米等敏感的后茬作物产生药害[8]，严重影响黑龙江省种植业结构的调整和换茬轮作，成为亟待解决的农业生产问题。

谢娜等研究表明，不同玉米品种对烟嘧磺隆、氯吡嘧磺隆和氯嘧磺隆的耐药性存在差异，不同玉米品种对磺酰脲类除草剂耐药性产生差异原因与除草剂靶标酶和代谢酶有关[9-11]。但不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性差异及其机制尚未见报道。为此，本研究针对氟磺胺草醚残留问题，采用盆栽毒土法测定不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性差异，以其靶标酶、叶绿素含量及光合速率等指标为研究对象，初步探讨其产生差异原因，旨在为合理轮作换茬、解决氟磺胺草醚的残留药害问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试玉米品种

兴垦3、边单3、龙育4、龙育875、龙育467、高油186（青贮）、垦粘1号、先玉335、粘糯2000、东农888、平全13、阳光1号，吉单27、丰合10、龙单38、宾玉2号；供试土壤为黑土，未使用过除草剂。土壤理化性质为：有机质39.6 g·kg-1，速效氮161.0 mg·kg-1，速效磷68.0 mg·kg-1，pH 6.64。

1.1.2 供试药剂及试剂

25%氟磺胺草醚水剂，大连松辽化工有限公司生产。原卟啉IX，购自Sigma公司，HEPES、Tris、DTT、EDTA、MgCl2、蔗糖、吐温80、盐酸、甘油、牛血清白蛋白（BSA）、考马斯亮蓝G-250及其他试剂，均购自哈尔滨万泰生物技术有限公司。

1.1.3 试验仪器

1-15K高速冷冻离心机，Sigma公司产品；96OMC型荧光分光光度计，上海科晓科学仪器有限公司产品；Li-6400XT光合分析仪，北京力高泰科技有限公司产品；SPX-250C型智能生化培养箱，上海博迅实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性

采用室内添加法。首先选择籽粒饱满、大小均匀的玉米种子浸种24 h，然后在25℃恒温培养箱中催芽24 h，挑选芽长一致的种子备用。试验采用毒土法，土壤中氟磺胺草醚浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·kg-1，塑料杯（7 cm×11 cm）每杯装土200 g，播芽长一致的玉米种子4粒，4次重复。置于室温下培养，出苗后7 d调查株高，计算株高抑制率，利用浓度对数和抑制率进行回归分析，建立回归方程并计算IC50值，用以评价不同玉米品种对氟磺胺草醚敏感性差异。

1.2.2 原卟啉原氧化酶（PPO）活性的测定

1.2.2.1 溶液的配制

酶提取缓冲液组成为：0.05 mol·L-1HEPES、0.5 mol·L-1蔗糖、1 mmol·L-1DTT、1 mmol·L-1MgC12、1 mmol·L-1EDTA、0.2%BSA，以KOH溶液调pH 7.8。溶酶缓冲液的组成为：0.05 mol·L-1Tris、2 mmol·L-1EDTA、20%（V/V）甘油，以HCI调pH 7.3。反应缓冲液的组成为：0.1 mol·L-1Tris、1 mmol·L-1EDTA、4 mol·L-1DTT，以HCl调pH 7.5。测试缓冲液的组成为：0.1 mol·L-1Tris、1 mmol·L-1EDTA、5 mmol·L-1DTT，1%（V/V）吐温80，以HCl调pH 7.8。

1.2.2.2 反应底物的制备

配制10 mmol·L-1KOH的乙醇/水混合溶液（82%KOH 0.017 g，5 mL无水乙醇，蒸馏水定容至25 mL），精确称量4.5 mg原卟啉IX，用4 mL KOH的乙醇/水溶液溶解，再稀释至10 mL，避光氮气保护下，按1.5 g·L-1加入3%钠汞齐，反应2 h。避光氮气保护下过滤，用10%盐酸调pH 8，按1∶3的体积比加入反应缓冲液，分装至样品管中，每份1 mL，于液氮中保存（浓度约0.1 mmol·L-1）。

1.2.2.3 PPO的提取与测定

参照文献[12-14]方法。采用暗室中培养的玉米黄化苗（土壤经不同浓度氟磺胺草醚处理，空白土壤为对照），照光2 h微变绿后，取地上部分剪碎后加5倍体积的提取缓冲液，经高速匀浆机匀浆，以100目尼龙绸过滤后再以800×g离心2 min（温度为0℃），取上清液并以17 000×g离心6 min（温度为0℃）。沉淀以溶酶缓冲液溶解后，即为酶样品，-70℃保存，操作在0～4℃下进行。在15 mL的具塞试管中加入反应缓冲液和100 μL的酶样品，于30℃水浴中振荡暗反应10 min后加入50 μL原卟啉原IX溶液，总体积为1 mL，置于30℃水浴中振荡暗反应30 min，后加入2 mL测试缓冲液后立即测定波长630 nm（激发波长为410 nm）处的发射荧光强度。以加热灭活的酶样品为空白对照。每个处理重复3次。

1.2.2.4 蛋白质含量测定

采用改进的考马斯亮蓝法[15]。取60 mg考马斯亮蓝G-250溶于100 mL 3%过氯酸溶液中，滤去未溶染料后，置于棕色瓶中保存。以牛血清白蛋白（BSA）为标准品作标准曲线。取1 μL酶样品，加蒸馏水至200 μL，加200 μL染液。于波长620 nm处比色测定吸光度。每个处理重复3次，取平均值。以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。依据标准曲线回归方程计算酶蛋白含量。

1.2.3 叶绿素含量测定

叶绿素含量测定采用比色法[16]。先将丙酮和无水乙醇等量混合成浸提液，将所测材料剪碎后加10 mL浸提液，加塞置暗处，于室温（10～30℃）下进行浸提。一定时间后观察浸提情况。待材料完全变白，即可测定浸提液的光密度。将色素提取液倒入厚度为1 cm比色皿中，将波长分别调至663和645 nm处，用丙酮和无水乙醇等量混合液调零，测定两波长处的光密度值。将663和645 nm处测得的光密度值代入公式，将663和645 nm处测得的光密度值代入如下公式：

式中，CA代表叶绿素a含量、CB代表叶绿素b含量、CT代表总叶绿素含量。根据（1～3）式计算出提取液中叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素浓度。再将叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素浓度值代入（4）式，求出所测材料单位质量或单位面积的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量。

1.2.4 光合速率测定

选择大小均匀的玉米种子浸种24 h，然后在25℃恒温培养箱中催芽24 h，挑选芽长一致的种子备用。试验采用毒土法，土壤中氟磺胺草醚浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·kg-1，塑料杯（7 cm×11 cm）每杯装土200 g，播芽长一致的玉米种子4粒，4次重复。置于温室中培养，常规管理。至玉米苗长至8～10片叶时，利用Li-6400XT光合分析仪测定第六片叶的光合参数，包括净光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度、蒸腾速率。所有项目均在9:00～11:00测定，各指标值为测定时段内的平均值。

1.3 数据分析

试验数据分析方法采用Excel 2003进行数据处理，采用DPS v7.05软件进行统计分析。用Duncan′s新复极差法（DMRT）进行处理间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性

室内毒土法测定玉米对氟磺胺草醚敏感性，试验结果表明，在＜0.2 mg·kg-1残留量下，氟磺胺草醚对不同玉米品种药害较轻，植株生长基本正常，在≥0.2 mg·kg-1残留量下，氟磺胺草醚对部分敏感玉米品种产生药害症状，而在≥0.4 mg·kg-1残留量下，氟磺胺草醚对所有试验品种均产生药害，但不同玉米品种敏感性存在差异。其中，爆裂玉米东农888对氟磺胺草醚最敏感，IC50为0.59 mg·kg-1，其次为垦粘1号，IC50为0.65 mg·kg-1，耐药倍数仅为1.10；龙467、高油186、龙单38等8个品种的敏感性中等，IC50为1.70～3.10 mg·kg-1，耐药倍数在2.88～5.25之间；吉单27、先玉335等6个品种表现出较强的耐药性，IC50为3.37 mg·kg-1以上，耐药倍数在5.71以上，其中，吉单27耐药性最强，IC50为5.21 mg·kg-1，耐药倍数高达8.83（见表1）。

表1 不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性差异Table 1 Relative sensitivity of different maize varieties to fomesafen

2.2 氟磺胺草醚对4种玉米原卟啉原氧化酶(PPO)活性的影响

由图1可知，未施药处理组东农888、吉单27、垦粘1号和先玉335 PPO活性随时间延长有一定波动，但差异不大；药剂残留处理组氟磺胺草醚对4种玉米的PPO活性抑制率均随残留量增加而逐渐增大，但对东农888、吉单27、垦粘1号和先玉335的PPO活性影响不同。

氟磺胺草醚0.1～0.8 mg·kg-1残留量下，吉单27的PPO活性抑制率变化幅度为1.1%～11.7%，先玉335的PPO活性抑制率变化幅度为1.2%～20%，垦粘1号的PPO活性抑制率变化幅度为5.6%～31.9%，东农888的PPO活性抑制率变化幅度为9.4%～39.1%，可见，氟磺胺草醚对玉米PPO活性的影响与品种的耐药性呈负相关，对耐药性较强的吉单27、先玉335的PPO活性影响较小，而对敏感的垦粘1号、东农888的PPO活性影响较大，且二者间差异显著。

图1 氟磺胺草醚对玉米原卟啉原氧化酶(PPO)活性的影响Fig.1 Effect of fomesafen on protoporphyrinogen oxidase(PPO)activity in maize

2.3 氟磺胺草醚对玉米叶绿素含量的影响

氟磺胺草醚对吉单27、先玉335两个品种的叶绿素a、b含量有一定影响，但变化幅度比较缓慢，且随着除草剂残留量的增加，叶绿素a、b含量逐渐降低，当氟磺胺草醚残留量为0.1～1 mg·kg-1时，对吉单27和先玉335叶绿素a+b抑制率分别为9.6%～30.9%和9.2%～37.9%；而氟磺胺草醚对垦粘1号和东农888两个敏感品种的叶绿素a、b含量影响较大，随着除草剂残留量的增加，垦粘1号和东农888的叶绿素a、b含量快速降低，氟磺胺草醚残留量为0.1～1 mg·kg-1时，对敏感品种垦粘1号和东农888的叶绿素a+b抑制率分别为3.1%～62.6%、7.0%～71.9%（见图2～4）。

图2 不同浓度除草剂对玉米叶绿素a（鲜重）含量的影响Fig.2 Effect of different concentrations of herbicides on chlorophyll a content(fresh weight)in maize

图3 不同浓度除草剂对玉米叶绿素b(鲜重)含量的影响Fig.3 Effect of different concentrations of herbicides on chlorophyll b content(fresh weight)in maize

图4 不同浓度除草剂对玉米叶绿素a+b(鲜重)含量的影响Fig.4 Effect of different concentrations of herbicides on chlorophyll a+b content(fresh weight)in maize

结果表明，当氟磺胺草醚土壤残留量达到0.2 mg·kg-1以上时，无论耐药性品种还是敏感品种，叶绿素均受到明显抑制，耐药品种叶绿素抑制率变化幅度较小，敏感品种叶绿素抑制率变化幅度较大，二者间差异极显著。这一试验结果也验证了上述PPO活性变化的规律。

2.4 氟磺胺草醚对玉米光合速率的影响

玉米叶片净光合速率随着除草剂残留量的增加逐渐降低（见图5）。

当氟磺胺草醚残留浓度为0.1 mg·kg-1时，对4种玉米品种吉单27、先玉335、垦粘1号和东农888间净光合速率抑制率差异不显著。当氟磺胺草醚残留浓度为0.2～1 mg·kg-1时，对4种玉米品种吉单27、先玉335、垦粘1号和东农888净光合速率抑制率逐渐增大，分别为17.3%～94.1%、19.2%～96.4%、27.1%～98.1%及30.8%～99.5%，浓度为0.2～0.4 mg·kg-1时，耐药性品种吉单27和先玉335净光合速率抑制率显著低于敏感性品种垦粘1号和东农888，当氟磺胺草醚残留浓度＞0.6 mg·kg-1时，对4种玉米品种净光合速率抑制率均明显增大，且差异不显著。

玉米叶片气孔导度和蒸腾速率随除草剂残留量增加逐渐降低（见图6～7）。当氟磺胺草醚残留浓度为0.1～0.2 mg·kg-1时，对4种玉米品种吉单27、先玉335、垦粘1号和东农888的气孔导度和蒸腾速率抑制率品种间差异不显著，而当氟磺胺草醚残留浓度达0.4～1 mg·kg-1时，对4种玉米品种吉单27、先玉335、垦粘1号和东农888气孔导度和蒸腾速率抑制率逐渐增大，气孔导度抑制率分别为17.3%～89.7%、19.0%～94.1%、23.4%～97.2%及25.2%～97.8%，蒸腾速率抑制率分别为16.4%～93.1%、17.7%～94.6%、19.7%～97.8%及20.2%～99.5%，耐药性品种吉单27和先玉335的气孔导度和蒸腾速率抑制率要显著低于敏感性品种垦粘1号和东农888，但当氟磺胺草醚残留浓度＞0.6 mg·kg-1时，对4种玉米品种的气孔导度和蒸腾速率抑制率均明显增大，且差异不显著。

图6 不同浓度除草剂对玉米气孔导度的影响Fig.6 Effect of different concentrations of herbicides on stomatal conductance in maize

图7 不同浓度除草剂对玉米蒸腾速率的影响Fig.7 Effect of different concentrations of herbicides on transpiration rate in maize

胞间CO2浓度随着氟磺胺草醚残留量的增加而增大（见图8），不同玉米品种间增幅存在差异，当氟磺胺草醚残留浓度为0.1～0.2 mg·kg-1时，不同玉米品种间胞间CO2浓度增幅差异不显著；当氟磺胺草醚残留浓度为0.4～1 mg·kg-1时，耐药性品种吉单27和先玉335的胞间CO2浓度增幅显著低于敏感性品种垦粘1号和东农888。

图8 不同浓度除草剂对玉米胞间CO2浓度的影响Fig.8 Effect of different concentrations of herbicides on intercellular CO2concentration in maize

3 讨论

除草剂当茬和残留药害普遍发生[17]，已有研究表明，不同作物或同一作物的品种对除草剂敏感性不同[9-11]，所以即使是同一作物产生除草剂药害的症状也会有差异。氟磺胺草醚残留对玉米可产生药害，但不同玉米品种敏感性存在差异。氟磺胺草醚在低于0.2 mg·kg-1的残留量下，玉米药害较轻，植株生长基本正常；在残留量高于0.2 mg·kg-1低于0.4 mg·kg-1时，氟磺胺草醚对部分敏感玉米品种产生药害症状；而在残留量≥0.4 mg·kg-1时，氟磺胺草醚对所有试验品种均产生药害，叶片扭曲，叶脉失绿淡黄色或紫色，底部叶片下垂干枯，严重的整株逐渐干枯死亡。

除草剂对作物的生理生化影响复杂，研究结论不同。据报道，除草剂丙草胺、丁草胺均可以降低水稻叶绿素含量[18-20]。玉米叶片叶绿素含量的消长规律是反映叶片生理活性变化的重要指标之一，与叶片光合机能大小具有密切关系[21]。光合作用是决定作物产量的最重要因素，除草剂药害对作物叶绿素含量、光合效率影响直接影响作物产量高低。随着氟磺胺草醚残留量的增加，对玉米叶绿素含量和光合速率影响增大，抑制率大小与玉米对氟磺胺草醚耐受能力呈负相关。

为探究作物对除草剂药害耐受能力产生差异机理，Inna等进行深入研究，将表达拟南芥质体PPO的基因组引入到烟草作物中，用二苯醚除草剂处理后，只检测到少量原卟啉Ⅸ积累，破坏催化反应不明显，不造成光反应的破坏，PPO超表达抵消二苯醚除草剂类除草剂功能，从而产生耐药性[22]。本试验4种玉米在氟磺胺草醚残留条件下，PPO活性发生改变，其降低幅度为敏感品种＞耐药品种，这与氟磺胺草醚残留对玉米叶绿素含量和光合速率影响的研究结果类似，综合前人及本试验结果可以推断，PPO的活性差异是玉米对氟磺胺草醚产生耐药性的原因之一。

苏少泉研究认为，除草剂的选择性与其靶标酶和代谢酶活性密切相关，耐药性植物的代谢酶活性高，能够迅速代谢植物体内除草剂使其丧失活性[23]。GSTs和细胞色素P450活性是植物抵抗除草剂胁迫的重要指标，与作物对除草剂的耐药性有密切关系[24]，但是否与玉米对氟磺胺草醚的耐药性有关系，还需进一步试验研究。

4 结论

不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性存在差异。爆裂玉米东农888对氟磺胺草醚最敏感，IC50为0.59 mg·kg-1，吉单27对氟磺胺草醚耐药性最强，IC50为5.21 mg·kg-1。

当氟磺胺草醚土壤残留量达到0.2 mg·kg-1以上时，无论耐药性品种还是敏感性品种，叶绿素均受到抑制，耐药品种抑制率变化幅度较小，敏感品种抑制率变化幅度较大。氟磺胺草醚残留对玉米叶片光合速率影响很大，且不同玉米品种间有差异。当氟磺胺草醚残留浓度为0.1 mg·kg-1时，对4种玉米品种吉单27、先玉335、垦粘1号和东农888间光合速率抑制率差异不显著。当氟磺胺草醚残留浓度在0.2～0.4 mg·kg-1范围内，耐药性品种吉单27和先玉335光合速率抑制率要显著低于敏感性品种垦粘1号和东农888，当氟磺胺草醚残留浓度＞0.6 mg·kg-1时，对4种玉米品种的净光合速率抑制率均明显增大，差异不显著。

未施药处理组东农888、吉单27、垦粘1号和先玉335 PPO活性随时间延长有一定波动，但差异不大；药剂残留处理组氟磺胺草醚对4种玉米的PPO活性抑制均随残留量增加而逐渐增大，但对4种玉米的PPO活性影响不同，其抑制率大小为敏感品种＞中等敏感品种＞耐药品种，与玉米对氟磺胺草醚的耐受能力呈负相关。这与氟磺胺草醚残留对玉米叶绿素含量和光合速率影响的研究结果相一致。

本研究结果表明，氟磺胺草醚是通过抑制玉米的PPO活性，进而降低玉米叶绿素含量及光合效率，最终影响作物产量，且药害程度与氟磺胺草醚残留量呈正相关。因此，生产上要严格控制长残留除草剂用药量，利用混合用药及提高施药技术等措施降低长残留除草剂用量，从而降低长残留除草剂的土壤残留量，减少长残留除草剂对后茬敏感作物的药害。

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Sensibility difference between different varieties of maize to fome⁃ safen

GUO Yulian1,SONG Weifeng2,LI Ming2,HUANG Chunyan1,WANG Yu1,HUANG Yuanju1
(1.Institute of Plant Protection,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086, China;2.Pesticide Research Center,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

In order to estimate the security of fomesafen to maize,we discussed the sensibility difference and the mechanism between different varieties of maize to fomesafen through the toxic soil method and the determination of enzyme activity.There were large differences of the sensibility to fomesafen among different maize varieties.And the most sensitive one was Dongnong888,IC50was 0.59 mg·kg-1,and Kennian1 was the next,the resistance index was only 1.10.The sensibility of other eight varieties such as Long467,Gaoyou186 and Longdan38 was medium.The resistance index was among 2.88-5.25;the sensibility of the six varieties such as Jidan27,Xianyu335 was strong.The resistance index was among 5.71-8.83. The sensibility differences between Jidan27,Xianyu335,Dongnong888 and Kennian1 were significant.The effect of fomesafen to the PPO activity,chlorophyll content and photosynthetic rate was gradually increased by the increase of residual quantity.The suppression of fomesafen to the PPO activity,chlorophyll content and photosynthetic rate was negative correlated to the drug tolerance of variety.The results showed that the sensibility difference between different varieties of maize to fomesafen was originated to the difference between the PPO activities.

fomesafen;maize;sensibility;PPO;chlorophyll;photosynthetic rate

S513

A

1005-9369（2014）11-0014-08

2014-09-09

黑龙江省自然科学基金项目（C201007）；十二五国家科技支撑计划项目（2012BAD19B02）

郭玉莲（1970-），女，研究员，博士，研究方向为杂草防除、除草剂应用技术及环境毒理学。E-mail:ylguo70@163.com

时间2014-11-21 17:35:06[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141121.1735.019.html

郭玉莲,宋伟丰,李明,等.不同玉米品种对氟磺胺草醚的敏感性差异[J].东北农业大学学报,2014,45(11):14-21.

GUO Yulian,SONG Weifeng,LI Ming,et al.Sensibility difference between different varieties of maize to fomesafen[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(11):14-21.(in Chinese with English abstract)