高星爱，李 莉，赵新颖，郗登宝，刘海燕，那 伟，祝延立，刘金文，张永锋

（吉林省农业科学院，长春 130033）

纤维素分解微生物复合菌剂降解固态物料特性研究

高星爱，李 莉，赵新颖，郗登宝，刘海燕，那 伟，祝延立，刘金文，张永锋*

（吉林省农业科学院，长春 130033）

为提高纤维素类碳源物质降解能力，通过试验驯化得到可降解玉米秸秆微生物复合菌剂。将复合菌剂添加到以纤维素类物质（滤纸、打印纸、秸秆、报纸）作为培养基碳源物质的液体培养基中，分析菌剂反应前后培养基中碳源物质减重率。结果表明，滤纸、打印纸、秸秆、报纸减重率分别达到93.7%、83.2%、75.4%、61.3%。玉米秸秆横截面扫描电镜观察表明，复合菌剂处理前后，细胞结构变得疏松，产生裂缝和空洞，有效证实驯化微生物复合菌剂有助于降解纤维素碳源物质能力。为分离复合菌剂中的单菌株，利用功能菌培养机上产生的透明圈及颜色变化，分离出降解蛋白质、脂肪、纤维素及产酸菌株，利用16S rRNA序列分析，鉴定出4个菌属8种菌株，分别为Chryseobacterium indologenes Dan121、Chryseobacterium indologenes Dan191、Acinetobacter bereziniae Zhi71、Acinetobacter bereziniae Zhi77、Acinetobacter bereziniae Zhi111、Lactococcus garviae S36、Bacillus cereus M7、Bacillus cereus MP310。

微生物复合菌剂；生物质降解；碳源物质

农作物秸秆被直接燃烧和废弃，畜禽粪便大部分被直接排放到农村环境，会造成资源浪费、养分流失和环境污染。通过研究微生物降解转化技术，提高农业废弃物资源化利用效率，延伸生物质产业链，对吉林省发展现代化循环农业具有重要意义[1]。微生物处理农业废弃物技术反应条件温和、无污染环境等优点，但单一纯菌株在实际生产推广中，受环境影响，易被土著微生物杂菌替代，生长受到抑制，难以发挥正常活性。结合传统与现代生物学技术，构建驯化高效降解复合系，有利于秸秆纤维素等成分降解。利用外援淘汰法成功筛选驯化到能分解小麦，玉米，水稻等作物秸秆的复合微生物菌剂MC1[2]、BYND-8[3]、WSC-6[4]、XDC-2[5]和WDC-2[6]等。

本研究利用秸秆还田腐质后的土壤，通过筛选、驯化等手段，经过多代连续培养，驯化好氧降解高分子纤维素类物质的微生物复合菌剂。将该菌剂添加到纤维素类碳源的培养基里，分析纤维素类物质降解特性及菌株组成，为农业废弃物降解提供微生物菌种。

1 材料与方法

1.1 纤维素分解菌剂驯化及降解碳源物质特性

1.1.1 纤维素分解微生物菌剂筛选与驯化

复合菌剂培养条件与驯化方法参照文献[7]。利用6%NaOH溶液浸泡玉米秸秆为供试碳源，采集腐殖土壤，在35℃条件下静止培养1周，玉米秸秆出现明显分解时，将已分解的玉米秸秆转接于新鲜培养基中，转接过程中，淘汰分解较弱的群体，保留分解能力较强菌株。如此重复转接几代后，最终筛选出1组复合菌剂。

1.1.2 分解前后培养基中碳源物质重量变化

将纤维素类物质为碳源的培养瓶中的残渣过滤，烘干后称重。用水淘洗干净，105℃烘干称重，计算减重率[8]。

1.1.3 扫描电子显微镜（SEM）分析

取自微生物复合菌剂处理前后的玉米秸秆，用灭菌的盖玻片盖在秸秆的小部分，用4%戊二醛（pH 6.8,0.025 mol·L-1磷酸缓冲液）于4℃固定2 h，用磷酸缓冲液冲洗1 h，内冲洗4次，间隔为15 min；1%锇酸固定2 h，水洗5 min，50%酒精10 min，直到90%酒精系列脱水，95%丙酮10 min，100%丙酮10 min，乙酸戊酯15 min，干燥，喷金，用GEOM日本电子，GSM-5 600型号扫描电镜进行扫描，观察放大50倍和300倍样品。

1.2 分离单菌株培养基组成[9]

1.2.1 细菌基础（LB）培养基

牛肉膏5.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，NaCl 10.0 g·L-1，琼脂20.0 g·L-1，pH 6.8～7.2。用蒸馏水定容至1 L，121℃蒸汽灭菌20 min。

1.2.2 蛋白质分解细菌培养基组成

牛肉膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，脱脂奶粉1.5 g·L-1，琼脂2%。根据细菌产生酪蛋白酶可分解酪蛋白，细菌菌落周围的培养基上所形成透明圈，初步判断蛋白质分解菌。

1.2.3 产酸细菌培养基

LB培养基上添加葡萄糖8 g，1%溴甲酚紫指示剂2.5 mL，用蒸馏水定容至1 L，pH 7.0。35℃培养，培养基最初的紫色变为黄色，说明有产酸细菌生长。

1.2.4 脂肪分解细菌培养基

蛋白胨20 g，（NH4）2SO41 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.5 g，NH4NO35 g，NaCl 0.5 g，吐温-20 10 g，H2O 1 L，灭菌25 min后，菌种涂平板，观察菌株周围产生的透明圈。

1.2.5 识别纤维素分解菌培养基

K2HPO40.5 g，羧甲基纤维素钠1.88 g，刚果红0.2 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，琼脂20 g，明胶2.0 g，用蒸馏水定容至1 L。纤维素分解菌样本悬液涂布于培养基上，观察水解后的多糖同刚果红染料反应后的红色透明圈[10]。

1.3 分离筛选菌株16S rRNA同源性比较

复合菌剂中分离筛选单菌株通过16S rRNA基因序列鉴定，由韩国大田基础科学研究院提供数据。

2 结果与分析

2.1 驯化玉米秸秆降解微生物复合菌剂

为筛选常温高效产酶微生物复合菌剂，分别以自然腐烂的玉米秸秆、腐熟好的牛粪和堆肥为微生物源，通过外淘汰法培养，经过多代培养，筛选出一组常温分解纤维素的微生物复合菌剂CHW，培养箱温度保持35℃。

2.2 微生物复合菌剂对不同纤维素类碳源物质降解过程的观察

如图1所示，投入同一剂量的微生物复合菌剂，培养10 d后，观察复合菌剂在供试的碳源培养基中分解碳源物质能力。结果表明，与对照相比，能看出碳源物质软化为液态的现象。能证实驯化微生物群体分解纤维素类碳源物质能力。

图1 微生物复合菌剂对不同碳源物质降解前后效果Fig.1 Influence of microbial compound inoculants on different carbon source materials before and after degradation

将以上4种材料作为培养基的碳源物质，接种复合菌剂后，分析反应前后培养基中碳源物质减重率。结果表明，减重率分别达93.7%、83.2%、75.4%、61.3%，其中对滤纸的减重效果最明显（见图2）。

图2 不同碳源对减重率的影响Fig.2 Influence of different carbon sources on weight loss rate

刘东波等研究表明，以纤维素滤纸为碳源，接种生孢噬纤维细菌（Sporoc ytophaga sp.JL-01）后，反应到108 h已有86.55%的纤维素滤纸被降解[11]。玉米秸秆为碳源的培养基减重率大于报纸为碳源的培养基减重率，因为，供试碳源材料中，首先把玉米秸秆用6%氢氧化钠溶液浸泡，使秸秆中木质素含量降低。何品晶曾指出滤纸是由100%纤维素组成，报纸中有26%木质素[12]。本文筛选得到的复合菌剂对纯纤维素组成的滤纸表现出分解率高。

2.3 微生物复合菌剂处理前后玉米秸秆结构变化

以6%氢氧化钠预处理过的玉米秸秆为唯一碳源，接种复合菌剂后，利用扫描电镜观察菌剂接种前后玉米秸秆横截面结构变化（见图3）。

未经微生物处理的培养液，玉米秸秆表面结构紧密规整，而微生物复合菌剂发酵降解后的玉米秸秆，纤维素遭到破坏，结构变得疏松、不规则，存在空洞。随着放大倍数的增大，纤维素多孔性增加，被破坏的程度显示更加明显。

2.4 复合菌剂组成多样性-分离筛选单功能菌株

2.4.1 功能菌株的分离

筛选单菌株功能菌富集培养基中，每种培养基分别含脱脂奶粉、吐温-20、溴甲酚紫及羧甲基纤维素钠等影响分解的生长因子，采用平板稀释分离法，对复合菌剂中的菌群，进行单菌株分离，挑选菌落周围透明圈较大部分，重复进行多次分离培养。Dan121和Dan191两菌株在脱脂奶粉存在的培养基上产生透明圈，说明产生蛋白质分解酶（见图4A、B）。菌株Zhi71、Zhi77和Zhi111分解脂肪酶，在吐温-20存在的培养基的菌圈周围产生透明圈（见图4C、D、E）。在溴甲酚紫存在的培养基上，S36菌株把最初的紫色变为黄色，说明菌株分泌有机酸分解酶（见图4F）。M7和MP310两菌株在羧甲基纤维素钠存在的培养基上用刚果红染色，菌株的红色周围产生透明圈，说明这两菌株有纤维素分解能力（见图4G、H）。

图3 微生物复合菌剂处理前后玉米秸秆横截面扫描电子显微镜图Fig.3 Corn straw cross-sectionalscanning electron microscope before and after microbial compound inoculants treatment

图4 8种菌株在不同培养基上产生的颜色变化及透明圈Fig.4 Color change and clear zones around eight strains in different medium

2.4.2 单菌株16S rRNA系统发育树

分离获得的8种菌株16S rRNA序列见图5。

能分泌蛋白质分解酶的Dan121、Dan191两菌株鉴定为产吲哚金黄杆菌（见图5A），有待进一步分析菌株产酶生化特征。分解脂肪酶的菌株Zhi71、Zhi77、Zhi111鉴定为不动杆菌（见图5B、 C）。在溴甲酚紫指示剂存在的培养基上把最初的紫色变为黄色，S36菌株鉴定结果为乳酸链球菌（见图5D）。M7和MP310两菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌。同时结合透明圈结果（见图5E），筛选出8种菌株命名为分解蛋白质、分解脂肪、产酸、分解纤维素等菌株。

图5 16S rRNA序列分析构建系统发育树Fig.5 16S rRNA sequence analysis to construct phylogenetic trees

3 讨论与结论

本研究以腐熟好的土样为基质，通过限制性培养，经过多代筛选，驯化功能菌群，通过微生物间的组合，获得一组可降解玉米秸秆的微生物复合菌剂。何品晶等曾对滤纸、打印纸、报纸等3种样品进行生物质组成分析，其中滤纸是由100%纤维素组成，打印纸中有82%纤维素和17%半纤维素，比滤纸和报纸无纤维素相比，报纸中含有26%木质素[12]。本文利用纤维素类物质（滤纸、打印纸、秸秆、报纸）为唯一碳源的液体培养基，观察菌剂投入前后纤维素类物质的减重率，相比未添加外源菌的对照处理，明显看出碳源物质软化为液体的现象。利用玉米秸秆横截面扫描电镜观察表明，复合菌剂处理秸秆的纤维素结构疏松，产生裂缝和空洞。

秸秆等有机固体废弃物的厌氧分解是相互依赖连续的复杂生物化学反应，有功能各异的诸多微生物参与降解过程，各自的生化特征及对环境的要求互不相同、发挥不同功能。秸秆中的纤维素、半纤维素被微生物部分地分解，并转化为简单的小分子物质。利用平板透明圈法对复合菌剂进行分离，筛选出分解蛋白质、脂肪、纤维素及产酸等8种单菌株。通过16S rRNA序列分析构建系统发育树，鉴定出功能菌株分别属于吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium.sp），不动杆菌（Acinetobacter. sp.），乳酸链球菌（Lactococcus garviae），蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）4种不同属。其中在蛋白质培养基上能产生透明圈的Chryseobacterium indolo⁃genes Dan121，191两种菌株，从16S rRNA序列中鉴定为产吲哚金黄杆菌，有待于分析菌株产酶能力。这些单菌株获得，为每个不同生物酶应用开辟有效途径。在不同底物培养基上，每个菌株产酶能力及透明圈大小均不相同，与添加的诱导物及营养物质有关。适应环境的菌株，才可生存甚至成为优势群体，否则被淘汰。因此不同底物的培养基中，持有特定酶微生物才能生存并分泌所需酶。

菌株应用到实际生产中，需要对菌株进行基因改造等分子手段提高菌株酶活性，对产酶条件进行优化，微生物降解不能忽略环境因素影响，有必要研究调控因子对每个功能菌产酶影响、降解特性、降解机理，提高功能菌活性，发挥复合菌株的最大生产能力，实现降解纤维素等高分子化合物为主要成分的沼气发酵原料目的。

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Characteristics study in the solid material decomposing by cellulose producing microbial compound inoculants

GAO Xing'ai,LI Li,ZHAO Xinying,XI Dengbao,LIU Haiyan,NA Wei,ZHU Yanli,LIU Jinwen,ZHANG Yongfeng(Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China)

In order to rise up the gas production during the anaerobic fermentation of agricultural waste,a set of microbial inoculum(CPB)which can degrade maize straw was build up.Cellulose-riched materials filter paper,copy paper,rice straw and news paper were fermentated in the culture of CPB as the sole carbon source and their weight loss rate were reached at 93.7%,83.2%,75.4%and 61.3%,respectively after reaction.Cellulose-riched materials amended with the CPB were soften into liquid compared to non-amended control.Scanning electron microscopy(SEM)observation showed that the composite system of dealing with the straw cellulose structure was loose,cracks and holes.Degradation of cellulose-riched materials may be correlated with the lytic ability of microbial inoculum.Using functional bacteria on the culture of transparent circle and color changes,isolated from compound bacterium agent in the degradation of protein, fat,cellulose and producing acid strains,secondly using 16S rRNA sequence analysis,respectively identifiedChryseobacterium indologenesDan121,Chryseobacterium indologenesDan191,Acinetobacter bereziniae Zhi71,Acinetobacter bereziniaeZhi77,Acinetobacter bereziniaeZhi111,Lactococcus garviaeS36,Bacillus cereusM7,Bacillus cereusMP310 with four kinds of bacteria of the geus eight strains.

microbial compound inoculants;biomass degradation;carbon source materials

Q939.96；X787

A

1005-9369（2014）12-0071-06

时间2014-12-29 13∶45∶00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141229.1345.018.html

高星爱,李莉,赵新颖,等.纤维素分解微生物复合菌剂降解固态物料特性研究[J].东北农业大学学报,2014,45(12):71-73.

Gao Xing'ai,Li Li,Zhao Xinying,et al.Characteristics study in the solid material decomposing by cellulose producing microbial compound inoculants[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(12):71-76.(in Chinese with English abstract)

2014-02-24

国家科技支撑计划项目（2012BAD14B05）；吉林省科技厅国际合作项目（20120755）；2012年国家留学生择优资助项目（0111943）；吉林省科技支撑计划项目（20130206053NY）；吉林省农业科技创新工程项目（20121072）

高星爱（1978-），女，副研究员，博士，研究方向为能源微生物与生物质资源综合利用。E-mail：gao3598@163.com

*通讯作者：张永锋，研究员，博士生导师，研究方向为生物质资源综合利用。E-mail：nkyzhyf@126.com