任 雪 程谟斌 张 业 沈珝琲

近年来，乳腺癌的发生率和病死率呈逐年上升趋势，严重威胁女性健康。越来越多的研究结果表明乳腺癌干细胞在乳腺癌的发生、发展中起着重要的作用［1］。肿瘤发生侵袭和转移的过程中往往也发生了上皮间质转化，使上皮细胞获得间叶细胞的特点，获得肿瘤干细胞的特征［2］。MCF10A 是永生化的相对正常的乳腺上皮细胞系，其核型稳定，接近二倍体，并且MCF10A 为雌激素受体阴性，没有发生转化，不具有成瘤性［3］。但是在特殊培养条件或体外诱导条件下，MCF10A 能够发生转化，具有成瘤性［4］。利用MCF10A 构建诱导分化模型，能够模拟上皮间质转化过程，为探究上皮细胞癌变过程中是否会产生乳腺癌干细胞奠定基础。

本研究旨在构建能够被雌激素类似物他莫西芬激活的MCF10A - Er - Src 稳转细胞系，即MCF10A诱导转化模型，为乳腺癌相关研究奠定基础。

材料与方法

1.细胞:MCF10A 购自ATCC 细胞中心，HEK293T 为本组保存。

2.质粒:pMSCV-FLAG -HA、pCMV -VSV -G、pCMV -Gga-Pol 和pCMV-3Tag-7 -hER 为本组保存，pLNCX chick v-src 购自Addgene 公司。

3.试剂:DMEM 培养基、DMEM/F12 培养基和表皮生长因子EGF 购自Gibco 公司;马血清、胎牛血清购自Biochrom AG公司;氢化可的松(hydrocortisone)、霍乱毒素(cholera toxin)、胰岛素(insulin)、他莫西芬(Tamoxifen)、基因转染增强剂(polybrene)、嘌呤霉素(puromycin)、FLAG 抗体和FLAG -Ezview M2 珠子购自Sigma 公司;p-c-Src(Tyr416)抗体、HA 抗体和β-actin 抗体购自Santa Cruz Biotech 公司;GAPDH 抗体购自Abcam 公司;内切酶XhoⅠ、HpaⅠ、EcoRⅠ，Primer Star，dNTP Mix 和T4 DNA Ligase 购自TaKaRa 公司;Vigofect 转染试剂购自威格拉斯公司;BCA 法测定蛋白浓度试剂盒购自Pierce 公司;辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG 和抗兔IgG 购自MBL公司。

4.细胞培养:HEK293T 细胞系培养于DMEM 培养基(含10% 胎 牛 血 清、100μg/ml 青 霉 素 和100μg/ml 链 霉 素)。MCF10A 细胞系培养于DMEM/F12 培养基(含5%马血清……