刘德勇，张庆丽，龙晓兰，彭和人，谢海龙(.湖南环境职业技术学院病理教研室，湖南 衡阳 4005； .南华大学肿瘤研究所)

我国是原发性肝癌的高发区，死亡率居恶性肿瘤第二位，复发转移是肝癌死亡的主要原因[1]。目前肝癌的主要治疗方法是分子靶向治疗、化疗栓塞治疗、肝癌规范化治疗等[2-3]。S100钙结合蛋白A11(S100A11)是S100家族的重要成员之一[4]。研究发现S100A11与肿瘤的发生和转移密切相关，在结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中高表达，尤其是在肝癌中，S100A11高表达能促进肝癌的侵袭和迁移[5-8]。因此，S100A11可作为肝癌潜在的治疗靶点。本研究通过慢病毒感染建立Huh-7 S100A11稳定细胞珠，为肝癌的侵袭和迁移机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

293T细胞购自中国科学院上海生化细胞所；Huh-7细胞购自ATCC细胞库；Huh-7EGFRvIII细胞由本实验室构建保存。3种细胞均用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃ 5%CO2的条件下培养。

1.2 材料和试剂

限制性内切酶、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、Real-Time PCR试剂盒购自TaKaRa公司；dNTP购自Sangon公司；胎牛血清、DMSO、DMEM均购自Gibco公司；6孔板、冻存管、细胞培养皿购自Corning公司。T-PER 组织蛋白裂解液、BCA 蛋白分析试剂盒和Lumi-phosWB发光底物均购自Pierce公司；DNA提纯试剂盒购自Axygen公司；HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG抗体由上海康城公司生产；S100A11抗体购自abcom公司；慢病毒包装质粒pWPT、pAX2、pMD2.G由日内瓦大学T.Didier博士馈赠。所用引物均在上海Invitrogen公司合成。

1.3 慢病毒表达载体质粒构建及鉴定

提取细胞总RNA:Huh-7EGFRvIII细胞于6cm培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中常规培养。待细胞生长至90%左右，PBS洗细胞2次，加入1 mL Trizol，充分吹打后移至1.5 mL EP管中；加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15s，在室温下孵育5 min，12 000 g离心15 min；……