王俊梅 平苏宁 汪 泓 黄锦桃 陈大堤 李朝红

（中山大学中山医学院组织胚胎学教研室，广州510080）

疏松结缔组织平铺片制作与观察是我们组织学与胚胎学实验教学中学生们动手做的一个传统实验项目，过去常常使用甲苯胺兰染色，可以把结缔组织中的肥大细胞清晰显示，其它多数细胞核以及纤维的分布和数量亦可进行大概的了解，但结缔组织中的脂肪细胞却只是呈现空泡状，学生很难想象细胞内脂滴的形态和分布。由于脂肪组织在基础和临床研究中占越来越重要的位置，让学生们在短的时间内同时掌握结缔组织与脂肪组织的染色，并观察不同来源地的结缔组织中脂肪组织的分布，对于后续课程的学习以及科研思维培养具有重要意义。本研究对这一实验方法进行初步探讨，建立稳定的实验条件，使之具有制作快速、方法简易、结果稳定，可操作性强等特点，方便日后推广。

材料和方法

1.材料

小鼠疏松结缔组织，实验用解剖拨针，眼科剪刀，眼科镊子，载玻片，盖玻片等。

2.仪器

带数字摄影的光学显微镜。

3.试剂与配置

①油红o染色液：油红o 0.5g，50%乙醇100ml。将油红o溶于乙醇内，且不断搅拌至完全溶解即可［1］。配制好的染液置磨口瓶内保存备用。②0.3%甲苯胺蓝液：甲苯胺蓝0.3g，50%乙醇100 ml。③0.5%伊红染色液：伊红0.5g，50%乙醇100ml。

4.动物的处理和取材

健康成年小鼠1只，体重30～50g，断头处死，将肠系膜剪下，放置于干净的载玻片上，用解剖拨针将肠系膜轻轻薄层展开，借助于组织液黏附于载玻片上，使肠系膜展平绷紧。空气干燥5min。

5.染色步骤

①切片干燥后入50%乙醇稍洗；油红o乙醇染液作用8min［2］；②50%乙醇分化，自来水终止分化；③室温下加入甲苯胺蓝液到载玻片的结缔组织上，浸染10min；蒸馏水速洗；④室温下加入伊红染色液到载玻片的结缔组织上，染色30s，蒸馏水冲洗［3］；⑤甘油封片。

结 果

镜下可见通过甲苯胺蓝－伊红－油红o染色的疏松结缔组织平铺片呈现蓝色和红色染色（图1B），细胞和纤维均可清晰呈现，而单独用甲苯胺蓝染色主要呈现蓝色（图1A）。

细胞：两种染色方法均可清楚显示肥大细胞（图1A，1B）。肥大细胞成群分布，胞质紫红色，细胞浆内紫红色颗粒粗大而均匀分布，胞核淡染。除此之外，甲苯胺兰－伊红－油红o三色染色（图1B）还可以清楚显示红染的脂肪细胞（图1B左下角）。脂肪细胞成群分布，胞内含深度红染的脂滴。脂肪细胞大小不一，细胞内含脂滴大小也不一。比如，有些脂肪组织中央细胞胞浆内含有较大脂滴，而周边有些脂肪细胞脂滴含量很少，有些甚至胞浆中没有脂滴，该结果提示脂肪细胞具有不同的细胞表型。结缔组织细胞胞核清晰。

图1 甲苯胺兰－伊红－油红o三色染色结缔组织平铺片A图示肥大细胞，B图右上角紫红色染色的是肥大细胞，左下角为脂肪组织。放大倍数：物镜／目镜＝10×／10×。C图为A图局部放大，示肥大细胞，D图紫红色染色的是肥大细胞，红染为脂滴。放大倍数：物镜／目镜＝10X／40XFig.1 Oil red－toluidine blue－eosin triple staining of loose connective tissueFig.A shows the mast cells and the dark blue stained cells on the top of right side in Fig.B are mast cells，while the fat tissue lies on the bottom of the left side.10×10.Fig.C enlarge the mast cells in Fig.A and the fat droplets are red stained in Fig.D.10×40

讨 论

此研究有三个特点：一是在传统实验的基础上增加了新内容；二是增加了学生亲自动手做实验的分量；三是把科学研究的一些新的实验方法和新进展引入到本科实验教学中。

疏松结缔组织平铺片及复合染色是组织学与胚胎学教学的传统实验方法，学生可以自制标本并染色，可在30分钟内完成此实验，并获得实验结果。这是我们实验室实验教学中一直延续的做法。由于所用染料主要是甲苯胺兰，铺片中肥大细胞清晰可见。铺片中的脂肪细胞却呈空泡状，脂肪细胞形态十分不明。油红o为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色，脂肪滴呈红色，细胞核蓝色［1］。并且在配置油红o时进行技术改进，改用乙醇作为溶剂，可与甲苯胺兰的溶剂相同，使得两种染料趋于同性，可以很方便地获得了理想结果。因此，学生们只是在原先亲自动手做实验的基础上稍微增加了10分钟的时间，就可获得更多更美观的实验结果。更为重要的是，本方法的引入是由于参与教学的老师基于其课题研究所用的基本方法之一。李朝红教授［4］长期以来从事心血管重构分子机制与防治研究的课题，涉及到动脉粥样硬化等课题，其中有高血压、高血糖、高脂血症和肥胖等相关课题，油红o染色是其学科组常用实验研究方法之一。将其引入到本实验中供学生亲自动做，可行性强，无实验风险。此外，脂肪组织的研究近年来已呈现活跃的趋势，如脂肪干细胞、肥胖、高脂血症脂质代谢异常等均会涉及到此相关内容［5］。学生们通过亲自动手染色并观察结果，既可掌握了一种重要的科研实验方法为后续研究打下基础，更是通过对脂肪组织的染色和观察，在引导学生们学习正常的组织结构和功能的同时，增加学生们对临床相关学科的科研兴趣和现代最新知识的掌握，可谓是一举多得。本实验的预实验工作是在课题组研究生的帮助下实施完成的，这样既可提高研究生的带教水平，同时使得我们师资队伍得到了很好的补充，把教研室科研和教学工作连为一体，把年轻老师、研究生以及资深老教师科研工作紧密连接一体。使得人人热心投入到教学改革工作中来，真正做到教学科研相辅相成，达到学生最终受益的目的。

组织学新增实验必须考虑的一个重要事项就是所增加的实验必须要求在短时内能够完成，保证在有限的实验课时间内完成实验并获得结果。我们把新增的实验内容始终是放在从属位置，一定是要在保证完成最基本的实验要求的条件下去实施。实验是三个学时，至少两个学时用做验证性实验切片的观察，余下一个学时用于探索性实验。这样既可保证最基本的课程知识的掌握，又能在有限的时间内拓展相关知识和技能。因此，实验设计的好坏是决定能否最终成效显著的关键，而这又完全有赖于老师对教学改革工作的热爱、教学内容的熟练和关注程度。

［1］唐海林，唐荣军，宋颖等.一种改良的脂肪染色法.诊断病理学杂志，2006，13（2）：153－154

［2］周剑莉，胡检生.脂肪染色法在临床专业病理实验教学中的应用.山东医学高等专科学校学报，2011，33（1）：55－56

［3］刘同慎，李冰，殷彦君.疏松结缔组织铺片染色新法.滨州医学院学报，2001，24（5）：519－520

［4］李朝红.生物机械力对血管重构的影响及机制.中国动脉硬化杂志，2012，20（1）：1－5

［5］Padilla J，Jenkins NT，Vieira－Potter VJ，et al.Divergent phenotype of rat thoracic and abdominal perivascular adipose tissues.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2013 Apr 1，304（7）：R543－552