吴媛媛 汪 焕 张 瑞 赵 帅 刘雯婷 张盛周

（安徽师范大学生命科学学院生物环境与生态安全省级重点实验室，芜湖241000）

中华蟾蜍（Bufo gargarizans）隶属两栖纲无尾目蟾蜍科，在我国分布广泛，属两栖类的优势种群，捕食害虫，蟾酥和蟾衣可入药，具有重要的生态价值和经济价值［1，2］，也是重要的科研和教学用实验动物。中华蟾蜍人工养殖已引起广泛重视，目前对其一般生物学和药用价值方面的研究较多，但有关其消化机能方面的研究尚少［3，4］。本文对中华蟾蜍消化道粘膜酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、腺苷三磷酸酶（ATPase）、过氧化物酶（POX）、非特异性酯酶（NSE）和琥珀酸脱氢酶（SDH）等6种酶的活性进行了研究，旨在增进对其消化机能的认识，为其人工养殖提供基础资料。

材料和方法

1.材料

成体中华蟾蜍6只，购自芜湖水产市场，重200－250 g，穿刺毁股，立即解剖，取出整个消化道，用生理盐水洗净，按下列部位取材：食道，胃贲门，胃体，胃幽门，十二指肠，空肠，回肠和直肠。一组放置在－80℃冰箱中，利用冰冻切片技术对其进行切片，切片厚度为6μm；另一组于Carnoy氏液固定4h，常规石蜡包埋，并对其进行切片，切片厚度为6μm。

2.酶组织化学方法

酶的组织化学方法参照宋华［5］的方法进行滴染，略有改动。

2.1 ACP

用Carnoy氏液固定的石蜡切片，采用铅法显示。ACP作用试液为：0.1 mol／L醋酸缓冲液（p H 5.2）和0.24%硝酸铅溶液，3%β－甘油磷酸钠。35℃条件下，把做好的切片放入孵育液中25 min；蒸馏水滴洗2×2 min；再入1.5%硫化氨溶液2 min；蒸馏水滴洗2 min；无苏木精复染。活性部位成棕黄色沉淀。

2.2 ALP

采用NBT／BCIP法显示。ALP作用液为：碱性磷酸酶缓冲液（p H 9.2）；5%硝基蓝四唑（NBT）和5%5－溴－4－氯－3－吲哚－磷酸盐（BCIP）混合后在20 min内使用；把做好的冰冻切片放入作用液中20 min；蒸馏水滴洗2×3 min；无苏木精复染。活性部位成蓝紫色沉淀。

2.3 ATPase

采用钙－钴法显示。ATPase作用液为：腺苷三磷酸二钠盐（ATP钠盐）溶于蒸馏水然后用2 mol／L NaOH调p H至9.2，2%巴比妥钠溶液，2%无水CaCl2溶液，蒸馏水和2，4－二硝基苯酚混合液混匀后用2 mol／L NaOH溶液调p H至9.0；把做好的冰冻切片先放入1%CaCl2溶液中5 min；然后滴加上述过滤后的作用液放置35℃，50 min；蒸馏水2×2 min，入2%硝酸铅溶液内5 min；蒸馏水2×2 min，入4%中性甲醛溶液中固定2 min；蒸馏水滴洗2 min，入2%硫化氨溶液中2 min；蒸馏水滴洗2×3 min；无苏木精复染。活性部位成棕黑色沉淀。

2.4 NSE

采用偶氮法显示。NSE作用液为：α－乙酸萘脂，丙酮，0.1 mol／L PBS（p H 7.4）和六偶氮对品红混合后用2 mol／L NaOH溶液调p H至5.8，此溶液在20 min内使用；把做好的冰冻切片放入作用液中15 min；蒸馏水滴洗2×3 min；无苏木精复染。活性部位成棕红色沉淀。

2.5 POX

采用DAB法显示。POX作用液为：3，3－二氨基联苯胺（DAB），0.1 mol／L Tris－HCl缓冲液（p H7.6）和0.2%H2O2混合液混合后调p H至7.6；把做好的冰冻切片放入作用液中25 min；蒸馏水滴洗2×3 min；无苏木精复染。活性部位成棕黄色沉淀。

2.6 SDH

采用四唑盐法显示。SDH作用液为：0.4%硝基蓝四唑（NBT），0.1 mol／LPBS（p H7.4）和0.2 mol／L琥珀酸钠盐混合液混匀后滴加在事先做好的冰冻切片上，室温显示45 min；蒸馏水滴洗2×3 min；无苏木精复染。活性部位成蓝紫色沉淀。

3.光密度测定与数据统计分析

利用Olympus BX61型显微镜，在400倍视野下拍照。采用Image－Pro Plus图像分析软件，对酶组织化学染色阳性部位进行光密度分析，测出切片中阳性部位的累计光密度（integrated optical density，IOD）和面积（area），算出平均光密度（mean optical density，MOD）。阳性部位染色越深，平均光密度值越大，以平均光密度值表示消化道各部位酶活性的强弱，采用单因素方差分析（one－way ANOVA）对各种酶的活性变化进行差异显著性比较，P＜0.05为差异显著。

结 果

酶的组织化学染色显示6种酶在中华蟾蜍消化道中均有分布，且经光密度分析后，6种酶在消化道各段的活性存在一定的差异（表1）。

表1 中华蟾蜍消化道6种酶的分布Table 1 Distribution of six types of enzymes in the digestive tract of Bufo gargarizans

1.酸性磷酸酶（ACP）

ACP活性部位显示棕黄色硫化铅沉淀（图1，2）。ACP分布于除直肠外的整个消化道中，在胃贲门部酶活性最高，十二指肠和回肠酶活性较低（P＜0.05）。ACP在胃贲门部主要分布在胃贲门腺中，在上皮细胞中也有少量分布。在十二指肠和回肠中分布相似，酶活性均自粘膜上皮基底至纹状缘处逐渐增高，并在上皮细胞内呈颗粒状分布。

2.碱性磷酸酶（ALP）

ALP活性部位显示蓝紫色沉淀（图3）。ALP在整个消化道中均有分布，在十二指肠和空肠处酶活性最高，食管、胃幽门和胃体次之，胃贲门处酶活性显著较低（P＜0.05）。酶活性主要分布在消化道粘膜上皮，十二指肠和空肠酶活性主要分布在纹状缘处，而胃贲门中胃腺部酶活性显著高于粘膜上皮层。

3.腺苷三磷酸酶（ATPase）

ATPase活性部位成棕黑色（图4，5，6）。ATPase在消化道各段均有分布，以胃体和回肠酶活性显著较高（P＜0.05），直肠其次，十二指肠、空肠、食管和胃幽门次之，胃贲门处酶活性显著较低（P＜0.05）。ATPase酶活性主要分布在胃腺及消化道粘膜上皮中，胃腺中酶活性显著高于粘膜上皮层，肠道中酶活性自粘膜上皮至纹状缘处显著提高。

4.非特异性酯酶（NSE）

NSE活性部位显示棕红色沉淀（图7，8）。NSE在消化道各段均有分布，以空肠、食管和胃幽门酶活性显著较高，回肠和直肠其次，十二指肠和胃体较低，胃贲门酶活性最低（P＜0.05）。酯酶在消化道粘膜上皮中分布较多，在固有层也有分布，但主要还是分布在胃腺及贲门腺中，在食管中主要分布在上皮基底及近游离处。

5.过氧化物酶（POX）

POX活性部位显示黄棕色（图9，10）。POX在消化道各段均有分布，在空肠和胃贲门酶活性显著较高（P＜0.05），胃体、十二指肠和直肠其次，回肠酶活性显著较低（P＜0.05）。过氧化物酶在消化道粘膜上皮和固有层中均有分布，在胃贲门腺及胃腺中也有大量分布，且呈棕黄色颗粒状分布。

6.琥珀酸脱氢酶（SDH）

SDH活性部位成蓝紫色（图11，12）。SDH在消化道各段均有分布，以十二指肠和回肠中酶活性最高，胃体和胃幽门处其次，在胃贲门和空肠次之，食管和直肠最低（P＜0.05）。肠道中酶活性主要分布于纹状缘，在上皮基底未检测到酶活性，胃中胃腺酶活性显著高于粘膜上皮层。

图1 胃贲门酸性磷酸酶；图2回肠酸性磷酸酶；图3十二指肠碱性磷酸酶；图4胃体腺苷三磷酸酶；图5十二指肠腺苷三磷酸酶；图6直肠腺苷三磷酸酶；图7胃体非特异性酯酶；图8空肠非特异性酯酶；图9胃幽门过氧化物酶；图10空肠过氧化物酶；图11胃幽门琥珀酸脱氢酶；图12回肠琥珀酸脱氢酶。L：消化道腔；LP：固有层；CG：贲门腺；FG：胃底腺；PG：幽门腺；ME：黏膜上皮；SB：纹状缘；标尺：50μmFig.1 ACP in the stomachus cardiacus；Fig.2 ACP in the ileum；Fig.3 ALP in the duodenum；Fig.4 ATPase in the stomachus corpus；Fig.5 ATPase in the duodenum；Fig.6 ATPase in the rectum；Fig.7 NSE in the stomachus corpus；Fig.8 NSE in the jejunum；Fig.9 POX in the stomachus pyloricus；Fig.10 POX in the duodenum；Fig.11 SDH in the stomachus pyloricus；Fig.12 SDH in the ileum.L：lumen of the digestive tract；LP：lamina propria；CG：cardiac gland；FG：fundic gland；PG：pyloric gland；ME：mucosal epithelia；SB：striated border；Scale bar：50μm

讨 论

酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）普遍存在于动物的各组织中，是机体生长与发育、保持内环境稳定和维持机体健康所必须的酶。ACP是细胞溶酶体的一种标志酶，也是参与细胞内消化的重要水解酶，ACP活性越高，表明该部位胞饮作用和细胞内消化功能越活跃［6，7］。本研究显示中华蟾蜍ACP主要分布于胃贲门、十二指肠及回肠中，与牛蛙（Rana catesbeinana）［8］主要分布于胃部，黑眉锦蛇（Elaphe taeniura）［5］主要分布于十二指肠及空肠均不同，种间差异较明显。ALP参与脂类、葡萄糖、钙和无机磷酸盐等营养物质的吸收，一般把ALP作为营养物质吸收的标志酶［7，9］。尼罗非洲鲫鱼（Oreochromis niloticus）［10］和牛蛙［8］主要分布在肠道，本研究显示中华蟾蜍ALP主要分布于十二指肠和空肠，在其它部位也均有分布，与牛蛙ALP的分布基本一致。中华蟾蜍消化道ACP和ALP的分布表明中华蟾蜍胃和小肠黏膜均具有较强的细胞内消化功能，十二指肠和空肠是主要吸收部位。

腺苷三磷酸酶（ATPase）是位于细胞膜上的一种糖蛋白，主要参与维持细胞膜内外的离子梯度差，以及肠上皮细胞对营养物质的吸收［11］。牛蛙ATPase在消化道各段均有分布［8］，黑眉锦蛇除直肠外均有分布［5］，中华蟾蜍ATPase在胃体和回肠处酶活性较高。ATPase在胃中主要位于胃腺，可能与胃腺壁细胞分泌胃酸消化蛋白质和分泌粘蛋白促进食物吸收有关，回肠中则在纹状缘处酶活性较高，是消化吸收的主要部位。

非特异性酯酶（NSE）对于脂类代谢和生物膜的结构与功能具有一定作用，除了维持细胞正常的能量代谢外，还能水解大量非生理存在的脂类化合物［12］。尼罗非洲鲫鱼［10］主要分布在肠道，商城肥鲵（Pachyhynobius shangchengensis）［13］主 要 在 胃 体和肠，欧洲无须鳕（Merluccius merluccius）［7］和黑眉锦蛇［5］在消化道各段均有分布。本研究发现中华蟾蜍NSE在消化道各段均有分布，胃和肠道的粘膜上皮细胞及胃腺细胞活性较高，与牛蛙类似，显示两栖动物的肠道是脂类消化的主要部位。

过氧化物酶（POX）是一种生物氧化中的末端氧化酶，能够分解生物体内某些代谢产物，并且利用H2O2氧化酚类及胺类等有毒代谢产物，对机体有双重保护作用［14］。本研究显示中华蟾蜍POX酶活性除在空肠和胃贲门较高外，其它部位均显著较低，这与黑眉锦蛇［5］在直肠酶活性最高，商城肥鲵［12］在胃和肠活性较弱明显不同。POX在中华蟾蜍消化道各段均有分布，在胃和肠道分布较多，可能与这些部位代谢旺盛、产生较多毒性物质有关。

琥珀酸脱氢酶（SDH）属于膜结合酶，是脱氢酶中最重要的酶，是参与三羧酸循环的关键酶，其活性一般可以作为评价三羧酸循环运行程度的指标［15］。SDH在中华蟾蜍整个消化道均有分布，但主要分布在十二指肠和回肠处，可能与接受胃液、胰液和胆汁有关，是小肠消化吸收的重要部位，与黑眉锦蛇［5］分布在胃部有差异，体现了种间特异性。

总之，中华蟾蜍消化道粘膜6种酶的分布同其它动物有相似之处，亦有其自身特点。不同酶的分布和消化道各部位的生理机能密切相关。胃体、十二指肠、空肠和回肠是中华蟾蜍的主要消化吸收部位。

［1］顿爱社，王凡.蟾酥制剂治疗恶性肿瘤的研究进展.四川解剖学杂志，2004，12（2）：131－132

［2］高慧敏，吴喜燕，李宗云等.蟾衣化学成分及体外抗肿瘤活性研究.中国中药杂志，2011，36（16）：2207－2210

［3］张盛周，张帅，刘婷婷等.中华蟾蜍消化道内分泌细胞的分布与形态.解剖学杂志，2008，31（4）：519－521

［4］邓振旭，楚德昌，李春华.中华蟾蜍与黑斑蛙消化道粘液细胞的组织化学染色.四川动物，2008，27（4）：565－568

［5］宋华，朱红年，张盛周等.黑眉锦蛇消化道6种酶的组织化学定位.中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（5）：557－561

［6］Izagirre U，Ruiz P，Marigómez I.Time－course study of the early lysosomal responses to pollutants in mussel digestive cells using acid phosphatase as lysosomal marker enzyme.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2009，149（4）：587－597

［7］Kozaric Z，Kuzir S，Nejedli S，et al.Histochemical distribution of digestive enzymes in hake，Merluccius merluccius L.1758.Veterinarski Arhiv，2004，74（4）：299－308

［8］韦金鑫，郭慧，张盛周等.牛蛙消化道粘膜5种酶的分布.中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20（4）：316－319

［9］王秋颖.碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展.中国畜牧兽医，2011，38（1）：157－160

［10］Tengjaroenkul B，Smith BJ，Caceci T，et al.Distribution of intestinal enzyme activities along the intestinal tract of cultured Niletilapia，Oreochromis niloticus L.Aquaculture，2000，182：317－327

［11］Liquori GE，Zizza S，Mastrodonato M，et al.Pepsinogen and H，K－ATPase mediate acid secretion in gastric glands of Triturus carnifex （Amphibia，Caudata）.Acta Histochem，2005，107（2）：133－141

［12］区又君，齐旭东，李加儿.驼背鲈不同组织5种同工酶表达的差异.氨基酸和生物资源，2010，32（4）：5－7

［13］陈晓虹，王林嵩，瞿文元.商城肥鲵两种同工酶的研究.四川动物，2000，19（1）：13－14

［14］陈晓虹，王林嵩，瞿文元.河南省小鲵科两种动物酯酶、过氧化物酶同工酶的比较研究.动物学杂志，2000，35（5）：19－23

［15］Rutter J，Winge DR，Schiffman JD.Succinate dehydrogenase－Assembly，regulation and role in human disease.Mitochondrion，2010，10（4）：393－401