郑轶琦，郭琰，房淑娟，徐亚楠，陈静波，刘建秀

（1．河南科技大学林学院，河南 洛阳471003；2．江苏省中科院植物所，江苏 南京210014）

植物种质资源在植物遗传改良及生产发展中起着非常重要的作用，植物种质资源的收集和保存工作已经得到世界各国政府和科学家的广泛重视。随着收集、保存的种质资源数量的急剧增加，如何有效地对种质资源进行保存、更新和评价，高效发掘优异基因并进行利用，从而提高现有资源的利用率是种质资源管理者和育种工作者急需解决的科学问题。核心种质［1－2］的提出为解决这一问题提供了新的思路，并已在很多植物资源中得到广泛应用。它能以最小的资源数量和遗传重复性，最大程度地代表整个遗传资源的多样性，从而便于种质的保存、评价和利用。目前该研究多集中于农作物及园艺作物［3－10］，牧草和草坪草的研究相对较少。在牧草核心种质构建方面，目前已构建了多年生黑麦草（Loliumperenne）［11］、紫花苜蓿（Medicagosativa）［12］、一年生苜蓿（annualMedicago）［13］、牧草型狗牙根（Cynodonsp．）［14］等的核心种质。

狗牙根（Cynodondactylon）隶属于禾本科（Poaceae）狗牙根属（Cynodon），是世界三大暖季型草坪草之一。狗牙根是世界广布型草种，广泛分布于北纬53°至南纬45°的广大地区［15］。在我国，狗牙根主要分布于黄河流域及其以南各地，华北、新疆等地也有分布。国内外学者在狗牙根种质资源的收集、多样性评价等方面已取得较大的进展。目前国内外学者已经从形态特征［16－24］和分子水平［25－36］对狗牙根的遗传变异进行了相关研究，这些研究为狗牙根种源的遗传多样性系统评价和核心种质的构建奠定了良好的基础。

江苏省中科院植物所草坪组近年来收集了大量的狗牙根种源，目前已对所搜集的代表性资源在外部性状变异、物候期、形态类型、结实性、抗逆性、细胞学以及遗传多样性等诸多方面进行了广泛研究，丰富的种质资源为狗牙根的系统研究和遗传育种工作提供了大量的材料，然而，如此众多的资源给保存、评价、鉴定及利用带来了困难，如何更快、更有效地研究、利用现有的种质资源，对于加快发掘优异的资源为育种服务显得尤为重要。因此，进行狗牙根核心种质构建研究，对于种质资源创新和有效保护利用以及品种改良、新品种选育等具有十分重要的意义和应用前景。

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验材料为保存于江苏省中科院植物所草坪组种质资源圃的831份狗牙根种质资源。其中绝大多数为我国野生资源，分别来自福建（22份）、江西（6份）、上海（4份）、江苏（95份）、浙江（13份）、山东（18份）、安徽（32份）、湖南（71份）、湖北（41份）、河南（62份）、海南（57份）、广东（70份）、广西（52份）、贵州（11份）、四川（15份）、重庆（10份）、西藏（3份）、云南（27份）、陕西（5份）、新疆（12份）、甘肃（7份）、河北（10份）、北京（2份）、天津（1份）、台湾（1份）、国外引进（53份，包括美国47份，法国5份，卡塔尔1份）、辐射诱变材料（117份）、杂交后代（14份）。

1．2 性状测定方法

本试验从2011年6月至2012年6月进行，共测定15个性状，其中数量性状11个，质量性状4个。数量性状测定项目主要包括匍匐茎节间长度与直径、直立茎叶片长度与宽度、草层高度、生殖枝高度、穂长度、穗枝数、小穗长度与宽度、小穗数等11个性状，重复10次求平均。质量性状测定项目主要包括叶色、匍匐茎色、叶腹面毛及叶背面毛。具体测定方法参见刘建秀等［20］的报道。数量性状依均值（珡X）和标准差（σ）分为10级，1级Xi＜珡X－2σ，10级Xi＞珡X＋2σ，中间每级差0．5σ。

1．3 初级核心种质构建方法

以国家、省（直辖市、自治区）为单位分组，杂交后代和辐射诱变材料各自成一组，共计30组，在分组基础上，利用上述15个性状数据进行聚类分析，聚类方法采用类平均法，种源间遗传距离采用欧氏距离。从组内取样比例、总体取样规模和组内抽样方法3个方面筛选出构建初级核心种质的最佳策略。其中组内取样比例包括简单比例（P）、对数比例（L）、平方根比例（S）和多样性比例（G），具体计算公式［5－6］如下：

式中，Xi为第i组的样品份数，Hi为第i组的多样性指数。

其中多样性指数的计算方法为：

式中，Hi为各组平均多样性指数；k为性状数；l为性状代码数；i表示第i个性状；j表示第j个代码；Pij为某分组中第i个性状第j个代码出现的频率。

总体取样规模设5%，10%，15%，20%，25%和30%。组内取样方法使用随机取样和聚类取样，其中聚类取样方法根据每一轮聚类图中最低分类水平上的类（组）内的两个个体差异最小的一份剔除（组内只有一份材料则直接进入下一轮聚类分析），保留下来的材料再进入一轮聚类、抽样，直到所取材料样品量达到设定的要求。上述3个层次共组合成48种取样策略，为避免主要生物类型的遗漏，每个分组内保证至少有1份样品入选。

1．4 初级核心种质的代表性检测

本研究选择4个核心种质评价参数［7－9］，用于评价核心种质的代表性。分别是：均值差异百分率（mean difference percentage，MD）、方差差异百分率（variance difference percentage，VD）、极差符合率（coincidence rate of range，CR）和变异系数变化率（changeable rate of coefficient of variation，VR），各参数计算公式［9］如下：

式中，St是核心种质与全部种质进行t测验得到的均值差异显著（α＝0．05）的性状数，n是性状总数。

式中，SF是核心种质与全部种质进行F测验得到的方差差异显著（α＝0．05）的性状数，n是性状总数。

式中，RC（i）是核心种质第i个性状的极差，RI（i）是全部种质第i个性状的极差，n是性状总数。

式中，CVC（i）是核心种质第i个性状的变异系数，CVI（i）是全部种质第i个性状的变异系数，n是性状总数。在均值差异百分率小于20%，同时极差符合率大于80%的情况下，可以认为该核心种质能够代表初始种质的遗传多样性。并且，均值差异百分率越小，方差差异百分率、极差符合率和变异系数变化率越大，则核心种质越能代表原群体的遗传多样性［7］。

1．5 核心种质的确认

为评价所构建的初级核心种质的代表性，利用主成分分析和相关分析法比较初始种质和初级核心种质两者基于主成分的样品分布图及性状间的相关系数，对构建的初级核心种质进行确认［4，9－10］。应用SPSS 19．0软件进行相关分析和主成分分析。

2 结果与分析

2．1 狗牙根性状变异分析

以国家、省（直辖市、自治区）为单位分组，杂交后代和辐射诱变材料各自成一组，共计30组，各组15个性状的平均值见表1。狗牙根各性状具有广泛的变异，不同性状的变异程度不同，所有性状的变异系数均大于10%，最高可达100%以上（叶腹面毛和叶背面毛），不同种源性状间均有较大差异，表明该群体遗传变异丰富，遗传多样性分布范围较广，适于进行核心种质构建。

2．2 总体取样规模的确定

初级核心种质代表性评价参数结果见表2。按照均值差异百分率（MD）小于20%的评价原则，不同的总体取样规模下，5%，25%和30%的总体取样规模构建的各核心种质子集的均值差异百分率均不超过20%；10%，15%和20%的总体取样规模构建的各核心种质中均有超过20%的子集；比较各总体取样规模的平均均值差异百分率可以看出，25%和30%的平均均值差异百分率最低（10%），其次是5%（11．25%），15%（13．75%），10%和20%最高（15%）。因此通过比较均值差异百分率可以看出，5%，25%和30%的总体取样规模优于其他水平。按照极差符合率（CR）大于80%的评价原则，15%，20%，25%和30%的总体取样规模构建的各核心种质的极差符合率均大于80%，且平均极差符合率均大于90%。方差差异百分率（VD）和变异系数变化率（VR）越大，核心种质越能代表原群体的遗传多样性，48个核心种质子集中除RG25%和RG30%的变异系数变化率小于100%，其他46个均大于100%，说明每个核心种质均较好地保存了原群体的遗传变异，通过取样剔除了原群体中一些冗余的样品；变异系数变化率在25%的总体取样规模下整体偏高，平均为72．50%，在所有供试总体取样规模中最高。综合比较6种总体取样规模在保持核心种质各性状的均值与全部种质的一致性，降低遗传冗余度，保持性状的变异范围和提高变异水平中的作用，认为25%的总体取样规模是构建狗牙根初级核心种质的最佳总体取样规模。

2．3 组内取样比例的确定

从表2可知，4种组内取样比例构建的各核心种质的均值差异百分率，均有超过20%的子集，但平均均值差异百分率中简单比例和平方根比例最低（11．67%），低于对数比例（14．17%）和多样性比例（12．50%）。比较各核心子集的极差符合率可知，4种组内取样比例的平均极差符合率均大于80%，平方根比例最高（89．26%），12个核心子集中仅1个低于80%，其他组内取样比例的核心子集中均有2个子集低于80%。简单比例、平方根比例和对数比例的核心子集的变异系数变化率均大于100%，而多样性比例的核心子集中，有2个低于100%。平均方差差异百分率在4组内取样比例构建的核心种质中，以简单比例最高（70%），其次是对数比例和多样性比例（均为68．33%），平方根比例最小（66．67%），但总体相差不大。综合比较各核心子集中的评价参数可知，最佳组内取样比例为平方根比例。

2．4 组内取样方法的确定

比较两种取样方法可以看出，聚类取样法构建的核心子集各参数明显优于随机取样，均值差异百分率大于20%的子集全部采用随机取样法，极差符合率小于80%的子集也是采用随机法进行取样，此外采用聚类取样法构建的核心种质子集的变异系数变化率和方差差异百分率也普遍高于随机取样，所以聚类取样是构建狗牙根初级核心种质的最佳取样方法。

综合以上比较分析发现，在25%的总体取样规模下，组内采用平方根比例和聚类抽样方法是构建狗牙根初级核心种质的最适宜方法。

表1 各组狗牙根的性状平均值Table 1 The average value of bermudagrass traits from different groups

表2 初级核心种质子集的评价参数Table 2 Evaluation parameter of pre－core collection subset %

续表2 Continued

2．5 狗牙根初级核心种质

根据获得的最佳取样策略在表型水平建立了包含208份种质的狗牙根初级核心种质，该初级核心种质的具体构成如下：福建7份、江西4份、上海3份、江苏15份、浙江6份、山东7份、安徽9份、湖南13份、湖北10份、河南12份、海南12份、广东13份、广西11份、贵州5份、四川6份、重庆5份、西藏3份、云南8份、陕西3份、新疆5份、甘肃4份、河北5份、北京2份、天津1份、台湾1份、国外引进15份（包括美国11份，法国3份，卡塔尔1份）、辐射诱变材料17份、杂交后代6份。

2．6 初级核心种质的确认

比较初级核心种质和全部种质的主成分分析发现（表3），两者具有极为相近的特征值、贡献率和累计贡献率。以特征值大于1为标准，各自入选5个主成分，第1个主成分的特征值分别为3．788和4．346，贡献率分别是25．25%和28．97%，前5个主成分的累积贡献率分别是69．19%和71．62%，初级核心种质的建立能够排除冗余，使得累积贡献率有所提高。

表3 全部种质和核心种质主成分分析的特征值和累积贡献率Table 3 Eigen value and cumulative contributive percentage for the entire collection and pre－core collection

根据主成分分析结果，利用全部种质和初级核心种质中各株系在第1和第2主成分上的因子得分绘制二维散点图（图1）。图中全部种质的株系集中位于散点分布图的中部下方位置，并存在较重的相互重叠，表明这些样品存在较高的遗传相似性，同时也反映了全部种质的遗传冗余程度较高。初级核心种质中各株系分布的相互重叠程度得到了较大降低，表明初级核心种质的建立在一定程度上去除了全部种质中的遗传冗余。此外，从株系的分布格局可以看出，初级核心种质分布的几何形状和特征与全部种质非常相似，较多的外围个体被选入初级核心种质。因此，在25%的总体取样规模下，采用平方根比例和聚类抽样方法构建的狗牙根初级核心种质即降低了全部种质的遗传冗余，同时又确保了核心种质的代表性，很好地保存了全部种质的遗传多样性和结构。

在构建核心种质时，合适的取样策略应考虑相互适应的复杂表型相关性的保持情况［10］。全部种质与初级核心种质性状间相关分析结果见表4，在狗牙根全部种质中，55对性状呈极显著相关，11对性状呈显著相关；而在初级核心种质中，呈极显著相关的性状为53对，呈显著相关的性状为13对，初级核心种质中的性状间表型相关与全部种质基本一致，表明绝大多数性状的相关性得到了保持，控制这些相关的相互适应的遗传复杂性得到了适当并且充分的保持［4］。

图1 全部种质和初级核心种质的主成分分布图Fig．1 Principal component plots of entire collection and pre－core collection

3 讨论与结论

3．1 总体取样规模

确定合理的总体取样规模是构建核心种质的重要环节，过高的取样规模可能会导致核心种质的遗传冗余较高，反之则会导致核心种质的代表性下降及重要种质的丢失。目前核心种质构建中没有固定的总体取样规模，取样比例往往随着原始群体的大小而变化，一般原始群体数量越多，总体取样规模越小，原始群体数量越少，总体取样规模越大。Brown［2］提出在样品数不少于3000份时，以10%的总体取样规模就可以代表原始群体70%的遗传多样性。徐宁等［4］在对中国国家种质库中保存的4877份小豆（Vignaangularis）种质资源进行了核心种质构建，该核心种质占资源总量的8．92%，涵盖了98．3%的表型变异。李国强等［6］构建了国家蔬菜种质资源中期库收集的1651份大白菜（Brassicacampestrisspp．pekinensis）的核心种质，认为15%的总体取样规模较为合适。刘遵春等［9］对300份新疆野苹果（Malussieversii）资源进行了核心种质构建，以20%为最适宜的总体取样规模。徐海明等［37］构建的棉花（Gossypiumbarbadense）核心种质，其原始群体仅168份材料，取样比例高达30%。本研究通过对48种取样策略的比较，发现以25%的总体取样规模构建的核心种质既能保持核心种质各性状的均值和极差与全部种质的一致性，降低遗传冗余度，保持性状的变异范围和提高变异水平，认为25%的总体取样规模是构建狗牙根初级核心种质的最佳总体取样规模。

3．2 组内取样比例

在进行核心种质构建时，除了要确定合适的总体取样规模，对分组的种质还要确定合适的组内取样比例。本研究对4种常用的组内取样比例（简单比例、对数比例、平方根比例和多样性比例）进行了筛选，结果表明平方根比例是构建狗牙根初级核心种质的最佳组内取样比例。对于不同植物其组内取样比例的选择没有固定的方法，对结果也有着较大的影响。李国强等［6］认为多样性比例法是构建大白菜核心种质的最佳组内取样比例。李自超

等［38］在进行云南地方稻（Oryzasativa）种资源核心种质取样方案研究中对组内取样比例进行了筛选，认为平方根比例和对数比例较好。余萍等［39］在构建中国普通野生稻初级核心种质研究中发现对数比例法取样效果最好。齐永文等［40］对甘蔗（Saccharumsinense）细茎野生种核心种质构建策略中的组内取样比例进行了比较，认为简单比例法获得的核心种质代表性最好。不同的组内取样比例在进行抽样时都有其各自的优缺点，简单比例中各组的取样比例与组内材料数量占整个资源总数的比例一致，对于样品数量较多而遗传冗余较大的组别应用这种取样比例会增加核心种质的遗传冗余。对数比例和平方根比例中各组的取样比例分别由各组资源数量的对数值或平方根值占各组对数值或平方根值之和的比例决定，经对数或平方根处理，可以使核心种质中多样性的偏离得到部分修正。多样性比例是由组内的多样性占整个资源多样性的比例决定的，所以取样结果也较为可靠。此外不同种质的遗传结构和多样性情况各不相同，并且组内取样比例的确定还要结合取样策略中其他因子的组合情况，所以在进行核心种质构建中，针对不同的植物种类应该进行组内取样比例的筛选。

表4 全部种质（上三角）与初级核心种质（下三角）性状间相关分析Table 4 Correlation among the morphological characteristics in entire collection（above diagonal）and pre－core collection（below diagonal）

3．3 取样方法

取样方法决定了全部种质中的株系是否能入选核心种质，所以也是核心种质研究的重点。Frankel和Brown［1］认为，一个好的抽样方法不仅能最大程度地剔除群体的遗传冗余，而且能使核心种质的变异和对原群体遗传多样性的保有量达到最大化。由于资源的遗传多样性分布是不均匀的，因此采用随机取样和聚类取样将会获得多样性结构不同的核心种质［41］。Brown［42］曾指出，为获得种质资源所期望的最基本的遗传变异，可以考虑使用随机取样。Spagnoletti和Qualset［43］也曾在硬粒小麦（Triticumdurum）核心种质的构建过程中提出利用随机取样可以获得整个资源的无偏样本，但大多数研究均发现聚类取样的抽样效果明显优于随机取样［6，38－39，44］。聚类取样法可以从遗传距离较近的材料中剔除一定比例的样本，从而降低了原种质的遗传冗余并保持原种质的遗传结构，所以抽样结果优于随机取样。本研究对聚类取样和随机取样构建的核心子集进行了比较，发现聚类取样是构建狗牙根初级核心种质适宜的取样方法，进一步印证了聚类取样的抽样效果优于随机取样。

3．4 主成分分析和相关分析对核心种质的确认

一个代表性好的核心种质必须能最大程度的保存全部种质的株系分布特征以及性状间的相互关系，因此前人已经采用主成分分析来比较核心种质和全部种质的株系分布特征，用性状间的相关系数来推断全部种质中控制性状间相关性的内在共适应基因系统是否被核心种质很好地保留下来［4，9－10，45－46］。主成分分析可以将第1和第2主成分上的因子得分作为几何平面的横坐标和纵坐标，近似地描述样品在几何空间的分布特征，个体间距离的远近反映了它们在遗传上的相似程度，距离越近的个体相似性越高，反之则越低。因此，基于主成分的样品分布图可以近似地反映分析群体的遗传结构［9］。本研究通过比较初级核心种质和全部种质的主成分分布图，结果表明初级核心种质中各株系分布的相互重叠程度较全部种质得到了较大降低，表明初级核心种质的建立在一定程度上去除了全部种质中的遗传冗余，初级核心种质的株系分布特征也与全部种质非常相似。性状间的相关是物种的一个内在特性，是控制性状的遗传物质或生理代谢存在某种关联的外在表现，抽样不应改变这种生物固有的性状间的遗传相关［9］，本研究通过比较初级核心种质和全部种质的性状间相互关系，验证了所构建的狗牙根初级核心种质的代表性。所以通过上述两种分析方法的验证，进一步确认了在25%的总体取样规模下，组内采用平方根比例和聚类抽样方法是构建狗牙根初级核心种质的最适宜方法。根据获得的最佳取样策略最终在表型水平上建立了包含208份种质的狗牙根初级核心种质，该种质可以作为整体资源的代表性样本，在狗牙根种质资源的充分开发和利用中发挥重要作用。

基于表型数据构建核心种质一直以来都是核心种质构建的重要方法，也是传统方法，但由于表现型值不能真实反映基因型的差异，且易受外界环境条件的影响，所以基于表型数据得到的核心种质难以代表原有种质资源的遗传多样性［47］。使用分子标记的方法，能够在较短时间内获得大量的遗传信息，并且能很好的反映种质资源群体中个体间的亲缘关系，但由于分子标记实验的费用较高，而种质资源的原始群体一般规模庞大，因而很难对每个样品逐一进行分子标记检测。因此目前较多采用先利用表型数据构建初级核心种质，再利用分子标记对初级核心种质进行压缩。所以本研究先利用表型数据将原始群体压缩，构建初级核心种质，然后采用分子标记数据构建狗牙根的核心种质资源，最终将获得高质量的核心种质库。

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