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(青岛大学医学院,山东 青岛 266003 1 附属医院妇科； 2 病原生物学教研室)

宫颈癌是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤，近年来发病呈上升趋势，且病人逐渐年轻化。转移是影响宫颈癌预后的重要因素。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是一种高度保守、广泛表达的小分子胞浆蛋白，是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族成员，在细胞的多种信号转导通路中起重要的调节作用。近年来的研究结果显示，RKIP具有抑制肿瘤细胞转移的作用，RKIP在肿瘤治疗中的作用已成为肿瘤细胞生物学领域中的一个新的研究热点。已有研究结果显示，RKIP是一种新的前列腺癌转移抑制基因，RKIP在宫颈癌细胞及其转移的淋巴结组织中表达减弱或丢失[1-5]。因此推测RKIP基因可能在宫颈癌的发生、发展和转移中发挥重要作用。本研究采用脂质体转染法，将含有正义(ss)RKIP cDNA 的真核表达载体导入宫颈癌Caski细胞，建立RKIP表达上调的稳定转染细胞系，观察RKIP基因对宫颈癌细胞体外增殖、锚定非依赖性生长和侵袭等生物学行为的影响，为深入探讨RKIP基因在宫颈癌发生、发展、转移和预后中的作用及其机制奠定基础。 现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人宫颈癌细胞Caski细胞系，本实验室保存。细胞用含体积分数0.10胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2细胞培养箱内培养。真核表达载体pcDNA3.1(+)和含有ssRKIP cDNA 的质粒，由美国密歇根大学EVEN T KELLER 教授惠赠。DMEM培养基，购自Thermo scientific 公司；无内毒素FBS，购自杭州天杭生物科技公司；Matrigel基质胶，购自美国BD公司；牛血清清蛋白(BSA)，购自美国Sigma公司；Lipofectamine 2000 转染试剂，购自美国Invitrogen公司；G418，购自Amresco公司；羊抗人RKIP，购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗，购自北京博奥森公司。

1.2 实验方法

1.2.1RKIP基因转染及阳性细胞的筛选 转染前1 d，将人宫颈癌Caski细胞以每孔3×105个接种于6孔培养板， 24 h后达到90%细胞融合，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书步骤将pcDNA3.1(+)和 pcDNA3.1(+)-ssRKIP质粒分别转染到Caski细胞中。转染48 h后，细胞按照1∶4传代，用含500 mg/L G418的DMEM培养基进行筛选,每3 d换液1次。2～3周后挑取G418抗性克隆，200 mg/L G418维持浓度扩大培养，建立稳定转染细胞系。

1.2.2Westren-blot法检测转染前后细胞RKIP蛋白的表达 收集生长状态良好的稳定转染细胞及未转染细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min后，以12 000 r/min离心15 min，小心吸取上清即为细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定其蛋白浓度。取30 μg细胞总蛋白用120 g/L的丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，蛋白电转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h。然后用封闭液稀释的一抗室温孵育2 h(羊抗人RKIP抗体1∶25 000稀释，鼠抗人内参抗体1∶5 000稀释)；TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；封闭液稀释的二抗室温孵育1 h(辣根过氧化物酶标记的兔抗羊或抗鼠抗体1∶1 000稀释)；用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；ECL试剂发光、显影和定影。实验重复3次。结果应用Quantity One软件进行灰度值分析，以β-actin为内参照，以细胞转染前后RKIP蛋白与β-actin蛋白灰度值的比值作为RKIP蛋白的相对表达含量。

1.2.3MTT检测细胞增殖 取生长状态良好的pcDNA3.1(+)转染细胞、ssRKIP细胞、未转染的Caski细胞，以2.5×106/L的密度接种于96孔培养板中，每孔200 μL，每组设5个复孔，于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中分别培养12、24、36、48、60、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)后继续培养4 h，吸净培养液后每孔加入100 μL DMSO溶液，轻微震荡5 min待溶液完全溶解后，用酶标仪测定波长570 nm处的吸光度值(A值)。实验重复3次，计算出各时间点的平均值，绘制生长曲线,分析其增殖能力。

1.2.4双层软琼脂集落形成实验 将12 g/L琼脂与含体积分数0.10 FBS的DMEM培养基等体积混合，立即加入6孔培养板中，每孔1 mL，待琼脂凝固后备用；将6 g/L琼脂与含有密度2×107/L细胞及含体积分数0.20 FBS的DMEM培养基等体积混合，使细胞密度为1×107/L，分别加入到含有底层琼脂的6孔培养板中，每孔1 mL，每组细胞设3个复孔，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2饱和湿度培养箱内培养10～14 d。于倒置显微镜下计数细胞数大于50个的克隆，计算克隆形成的平均数。实验重复3次。

1.2.5Transwell小室侵袭实验 将小室置于4 ℃预冷后，滤膜底部涂以人工基底膜基质凝胶matrigel 25 μL(凝胶用无血清DMEM培养液稀释为0.2 g/L),37 ℃环境下作用30 min，待matrigel胶在微孔滤膜上重组为基底膜结构，PBS冲洗。24孔板内加入含1 g/L BSA的DMEM培养液，每孔600 μL。5种细胞胰酶消化后，用含有1 g/L BSA的DMEM培养液调整细胞密度为1×109/L，小室内加入100 μL细胞悬液后浸入含有1 g/L BSA的DMEM培养液中，于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱内孵育8～10 h。取出小室，PBS冲洗3次，结晶紫染色，棉签拭去膜表面上的细胞，高倍显微镜下观察并计数穿过膜的细胞数。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 稳定转染细胞系的建立

经过3周的G418(500 mg/L)筛选，成功建立了既上调表达RKIP基因又具有G418抗性的稳定转染宫颈癌Caski细胞(ssRKIP细胞)，并同时获得了空载体pcDNA3.1(+)稳定转染细胞(pcDNA3.1(+)细胞)。

2.2 转染前后细胞中RKIP基因表达的比较

与未转染细胞相比，ssRKIP细胞的RKIP蛋白表达水平上调，pcDNA3.1(+)转染细胞RKIP蛋白的表达水平变化不大(图1)；ssRKIP细胞RKIP蛋白的相对表达含量为2.13，空载体pcDNA3.1(+)转染细胞为1.12,未转染细胞为1.08。

2.3 RKIP基因转染前后各组细胞体外增殖能力的比较

实验48、60、72 h，空载体pcDNA3.1(+)转染细胞的体外增殖能力与未转染组细胞比较差异无显著性(t=2.13～3.20，P均>0.05)；ssRKIP细胞的体外增殖能力明显低于未转染组，差异有显著意义(t=6.22～7.16，P均<0.01)。见图2。

①未转染细胞；②pcDNA3.1(+)转染细胞；③ssRKIP细胞。

图2 RKIP基因转染Caski细胞前后细胞的体外增殖能力

2.4 RKIP基因转染前后细胞的锚定非依赖性生长能力比较

软琼脂集落形成实验结果显示，各组细胞均能在软琼脂中形成细胞集落。ssRKIP组细胞克隆形成数为112.78±5.60，未转染组为151.55±6.14，pcDNA3.1(+)转染组为159.11±3.64，ssRKIP组与未转染组相比较，差异有显著意义(t=8.14,P<0.01)；而未转染组与pcDNA3.1(+)转染组比较，差异无统计学意义(t=3.80，P>0.05)。

2.5 RKIP基因转染前后细胞体外侵袭能力比较

ssRKIP组穿膜细胞数为54.33±4.12，未转染组为80.00±3.20，pcDNA3.1(+)转染组为76.00±2.52，ssRKIP组与pcDNA3.1(+)转染组比较，差异有显著性(t=9.24，P<0.01)；pcDNA3.1(+)转染组与未转染组比较，差异无显著性(t=3.26，P>0.05)。

3 讨 论

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，转移是影响宫颈癌预后的重要因素之一。已有研究表明，Ⅰb～Ⅱa期的子宫颈癌病人若无盆腔淋巴结转移，其5年生存率可达85%～90%；而一旦有区域淋巴结转移，其5年生存率则降为30%～60%，即使常规病理检查无淋巴结转移等高危因素的病人，仍有10%出现复发和转移[1-2]。转移是一个复杂的、多步骤的癌细胞和宿主相互作用的过程。肿瘤细胞从原初病灶逃逸，进入循环系统，然后侵袭到一个远离的组织位点，在该靶位点生长成为一个肉眼可见的肿瘤。明确恶性肿瘤转移发生的关键机制，阻断肿瘤的转移是提高病人生存率、根治肿瘤的希望所在。

RKIP是近年来新发现的一种肿瘤转移抑制基因。FU等[3-4]研究显示，RKIP基因在转移的前列腺癌细胞C4-2B中的表达明显低于非转移性的前列腺癌细胞LNCaP，过量表达RKIP的前列腺癌细胞C4-2B的体外侵袭能力减弱，推断RKIP是一种新的前列腺癌转移抑制基因。随后，这一推断在黑色素瘤及乳癌中得到证明[8-11]。近年来有研究结果显示，RKIP在正常宫颈组织及宫颈上皮内瘤变组织的表达无明显差异，而在宫颈癌组织的表达低于正常宫颈组织及宫颈上皮内瘤变组织，在宫颈癌转移淋巴结组织的阳性表达率低于宫颈癌组织,推断RKIP基因在宫颈上皮内瘤变向宫颈癌转变中可能起重要作用，RKIP基因可作为宫颈癌良恶性鉴别诊断的标志，可能是宫颈癌的转移抑制基因[5-7]。另有研究显示，RKIP在高侵袭性宫颈癌细胞系Caski中的表达低于其他各组，认为RKIP基因与宫颈癌细胞的侵袭能力有关[7]。

为了进一步探讨RKIP基因在宫颈癌发展和转移中的作用，本研究采用脂质体转染的方法将含有ssRKIP cDNA 的质粒导入宫颈癌Caski细胞，建立了RKIP基因表达上调的稳定转染细胞系，结果显示，RKIP基因对宫颈癌细胞体外增殖、锚定非依赖性生长和侵袭能力等生物学行为均有明显的抑制作用。体外增殖实验及双层软琼脂集落形成实验结果显示， RKIP基因转染后细胞吸光度值明显低于未转染细胞，克隆形成数亦明显少于未转染细胞，说明RKIP基因表达上调能抑制Caski细胞的体外增殖和锚定非依赖性生长能力。该结果与LI等[12]对卵巢癌研究结果一致；但是与FU等[3]和SCHUIERER等[10]的研究结果不同，他们的结果显示，RKIP基因对前列腺癌细胞和黑色素瘤细胞的体外增殖、锚定非依赖性生长能力并无影响。

肿瘤的转移过程涉及多个步骤和环节，其中侵袭是比较重要的环节。本研究Transwell小室侵袭实验结果显示，RKIP基因表达上调的Caski细胞的体外侵袭能力减弱，说明RKIP基因能够抑制宫颈癌Caski细胞的体外侵袭能力。本实验结果与LI等[12]和FU等[3]研究结果一致。

本文研究结果还显示，上调表达RKIP基因后的Caski细胞的体外增殖、克隆形成数及穿膜细胞数均明显低于未转染细胞，表明RKIP基因不仅对宫颈癌细胞侵袭转移有抑制作用，对其生长增殖、锚定非依赖性生长能力也有抑制作用。鉴于抑制转移过程的基因(称为转移抑制基因)并不抑制原初肿瘤的生长，而本文结果显示RKIP对宫颈癌细胞的生长及侵袭均有抑制作用，因此我们初步认为，RKIP基因可能是宫颈癌的抑癌基因。

随着RKIP基因在多种肿瘤中转移抑制作用的不断被发掘，其在肿瘤基因治疗中的潜在价值也日趋显现。最新的研究结果表明，RKIP表达上调能增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性[13-14]。RKIP表达下调与肿瘤的恶性演化具有相关性，恢复RKIP表达能够改变其恶性侵袭和抗药性等恶性生物学行为，这些结果都将支持RKIP作为一个重要的抗肿瘤治疗靶点，并且已有Raf活性调节剂应用于临床，其治疗效果也令人鼓舞[15]。本研究观察RKIP基因上调表达对宫颈癌细胞生物学行为的影响，结果显示，RKIP基因与宫颈癌细胞的增殖及侵袭能力呈负相关，为宫颈癌的基因治疗提供了方向和依据。但RKIP基因对于宫颈癌细胞放化疗敏感性的作用尚需进一步研究。

综上所述，RKIP基因可能并不是宫颈癌的转移抑制基因而可能是抑癌基因。鉴于RKIP基因上调表达对宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力具有抑制作用，RKIP基因有可能成为宫颈癌治疗的新靶点。

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