(1 青岛大学医学院，山东 青岛 266021； 2 青岛市黄岛区中医医院)

角果木为红树科角果木属植物，富含鞣质、五环三萜和二萜。近年来角果木的药用价值得到国内外很多学者的重视，有学者用石油醚从角果木中部分分离提取出两种Dolabrane型二萜，其中Tagalsins A为首次发现的新化合物[1]。相关研究证实，角果木提取物——Tagalsin系列化合物具有细胞膜通透性和杀伤肿瘤细胞的活性，可以抑制多种人类恶性肿瘤细胞的增殖，具备新药开发价值[2]。本研究旨在观察Tagalsin对裸鼠皮下卵巢癌移植瘤组织中bcl-2、p53基因表达水平的影响，探讨Tagalsin对卵巢癌的干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌细胞株SKOV3购自广西医科大学附属肿瘤医院; 4～6周龄雌性BALB/C裸鼠60只，体质量15～20 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(SLAC); Tagalsin购自北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室；兔抗鼠bcl-2、p53一抗和SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司；RT-PCR逆转录试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司。

1.2 细胞培养和动物模型的建立

SKOV3细胞常规培养于含体积分数0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素各1 mL的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中，2.5 g/L胰酶消化后传代。收集对数生长期的细胞，制备成密度为3×1010/L单细胞悬液，于超净工作台内在裸鼠腋窝区皮下注射0.2 mL的单细胞悬液，注射局部出现明显皮丘，7 d后裸鼠均出现直径大于0.5 cm的皮下结节，病理切片证实为恶性肿瘤，此时移植瘤模型建立。

1.3 裸鼠分组及给药

将造模成功48只小鼠随机分为空白对照组、顺铂作用组、Tagalsin作用组和Tagalsin+顺铂组，每组为12只。Tagalsin每天灌胃给药1次(20 mg/kg)，顺铂每周腹腔注射给药1次(5 mg/kg)，连续3周。空白对照组用食用油代替药物。

1.4 移植瘤体积及抑瘤率的测定

观察裸鼠一般状态，每天测量裸鼠体质量。每3 d测量瘤体最长径(a)和最短径(b)，计算移植瘤的体积，移植瘤体积(mm3)=(1/2)ab2，求其平均值。根据移植瘤体积绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率[3]，抑瘤率=(对照组平均体积-实验组平均体积)/对照组平均体积×100%。停药后24 h处死裸鼠，完整剥离瘤体。

1.5 免疫组化检测P53、Bcl-2蛋白的表达

按SABC试剂盒说明书操作，以PBS代替一抗作为空白对照。Bcl-2定位于细胞质，P53定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒状。光镜下随机观察10个高倍视野，以细胞无着色或阳性细胞数<10%为(-)，阳性细胞数10%～25%为(+)，阳性细胞数26%～75%为()，阳性细胞数76%～85%为()，阳性细胞数>85%为()。

1.6 RT-PCR检测p53、bcl-2基因表达

取新鲜裸鼠移植瘤组织，按试剂盒说明书进行逆转录反应，合成的cDNA保存于-20 ℃，以β-actin为内参，行PCR扩增，扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，采用Quantity One图像分析软件进行分析。引物序列如下：p53-sense，5′-AGGACCCT-GTCACCGAGA-3′；p53-anti-sense，5′-GTGGAAGC-CATAGTTGCC-3′；bcl-2-sense，5′-GGTGGTGGAG-GAACTCTTCAGGG-3′；bcl-2-anti-sense，5′-GAGA-CAGCCAGGAGAAATCAAACAGA-3′；β-actin-sense:5′TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′；β-actin-anti-sense:5′-GATGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0及PPMS 1.5[4]软件进行统计学处理。多组均数的比较采用方差分析，非正态分布的样本比较采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组裸鼠移植瘤体积和抑瘤率比较

各药物作用组移植瘤体积明显小于空白对照组，其中Tagalsin+顺铂组移植瘤体积最小，差异有统计学意义(F=59.31,q=2.47～9.66,P<0.05)；顺铂作用组与Tagalsin作用组差异无显著意义(P>0.05)。见表1。

2.2 各组Bcl-2、P53蛋白表达比较

空白对照组、顺铂作用组、Tagalsin作用组及Tagalsin+顺铂组Bcl-2蛋白表达水平呈递减趋势，而P53蛋白表达水平则呈递增趋势，差异有统计学意义(u=3.425～9.652，P<0.05)；顺铂作用组与Tagalsin作用组之间差异无显著意义(P>0.05)。见表2。

表1 不同药物对裸鼠移植瘤生长影响±s)

表2 各组Bcl-2及P53蛋白表达比较(只)

2.3 各组bcl-2、p53 mRNA的表达

各药物作用组bcl-2基因表达均明显低于空白对照组，而p53基因表达则均明显高于空白对照组，其中以Tagalsin+顺铂组变化最明显；顺铂作用组及Tagalsin作用组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

3 讨 论

卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之一，由于缺乏典型的临床表现，目前很难做到早期诊断及早期治疗。且放化疗毒性作用使许多病人不能耐受。因此，寻找副作用轻且疗效好的药物已经成为研究热点。

利用红树植物治病，在中国民间已经有几百年的历史，但是直到近年红树植物才被作为海洋药物开发和新药研究的主要源泉之一，人们对红树植物的化学成分和生物活性进行了系统及深入的研究。很多研究表明，红树植物含萜类、多糖、甾体和生物碱等化合物，具有抑菌、抗氧化、抗艾滋病以及抗肿瘤等作用[5-6]。AGSHIKAR等[7]报道，红树植物具有麻醉和抗炎的作用。目前，关于红树植物生物活性及抗肿瘤作用的研究仅仅局限于体外细胞水平，关于其体内抗肿瘤作用及具体作用机制的研究鲜有报道。国内有学者通过动物实验证实，红树植物角果木Dolabrane型二萜对小鼠皮下肺癌移植瘤的生长具有明显的抑制作用，其抑制肿瘤的作用机制可能与肿瘤相关转录因子NF-κB p65的表达水平有关[8]。冯龄鑫等[9]研究显示，中国红树植物角果木中Dolabrane型二萜成分Tagalsins A，具有抑制小鼠皮下肝癌移植瘤生长及延长肝癌小鼠生存期的作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。

A：bcl-2 mRNA的表达，B：p53 mRNA的表达。①～④分别为空白对照组、顺铂作用组、Tagalsin作用组和Tagalsin+顺铂组。

bcl-2基因是从小鼠B淋巴瘤中分离得到的原癌基因。该基因能够抑制细胞凋亡，促进细胞异常增殖，导致肿瘤发生[10]。bcl-2基因发生突变而过度表达，则抑制了卵巢癌细胞凋亡，从而引起卵巢癌的发生。此外，细胞凋亡指数比较低的上皮性卵巢癌细胞，其bcl-2表达阳性率较高[11]。

p53基因是肿瘤抑制基因，分为野生型和突变型两种，野生型p53半衰期比较短，免疫组化技术检测不到，可通过引起DNA受损、细胞发生凋亡而阻止肿瘤的发生。突变的P53 蛋白在细胞内含量高，因构象发生改变，半衰期延长，并于核内积聚，免疫组化技术可以检测到。突变的p53基因产生的蛋白在肿瘤细胞中积累，可能是导致卵巢癌病人预后差的作用机制[12]。有研究显示，P53蛋白不仅可以反映卵巢癌的分化程度，而且随临床分期进展P53蛋白表达阳性率增高[13]。

本研究结果显示，各药物作用组移植瘤体积明显小于空白对照组，同时bcl-2基因表达明显低于空白对照组，而p53基因表达明显高于空白对照组，说明Tagalsin能有效抑制卵巢癌细胞的增殖，其抑瘤机制可能为通过上调卵巢癌细胞p53基因表达、下调bcl-2基因表达，从而调整了卵巢癌细胞周期，促进肿瘤细胞的凋亡。本文结果还显示，单独使用Tagalsin抑瘤作用与顺铂效果没有明显差别，但二者联合应用较单独使用抑制卵巢癌增殖的作用明显增强。本文结果为临床治疗卵巢癌药物的应用及新药研发提供了理论依据。

综上所述， Tagalsin有可能通过调控癌基因及抑癌基因的表达，调整细胞周期，从而有效地抑制卵巢癌细胞的增殖。但是Tagalsin的抑瘤作用是多因素的过程，目前对其他机制尚不十分明确，并且对于Tagalsin剂量的研究也较少，相信随着对海洋药物的不断深入研究和探索，上述问题会逐渐明确，为治疗卵巢癌的药物选择提供更多的理论基础。

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