张立新，冯才伟，贾芳芳 ，刘玉梅，杨 烁

（1.北京市优质农产品产销服务站，北京 100101；2.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206）

甲羟孕酮又称甲孕酮，是一种长期避孕药，也可用于一些对激素敏感肿瘤的姑息治疗；鱼类会因为水中微量的甲羟孕酮而改变性别。人食用含有甲羟孕酮的动物源性食品后，会扰乱人体内分泌、生长发育、免疫系统、生殖系统等方面的正常功能，还可能致癌、致畸，因此建立检测动物源性食品中甲羟孕酮残留的方法很有必要。目前，检测该类药物的方法主要是仪器法，但其资金、人员等成本投入较高，不宜推广。本试验运用酶联免疫检测法，测定了鸡肉和鱼肉中甲羟孕酮的残留量，旨在寻找成本更低的替代检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 甲羟孕酮ELISA检测试剂盒（包含96孔酶标板，甲羟孕酮标准品，酶结合物，底物液、终止液、洗涤液、复溶液），购自北京某生物技术有限公司；氢氧化钠、乙腈等购自北京某试剂公司；鸡肉、鱼肉样品购自超市；酶标仪购自上海某分析仪器有限公司，涡旋仪、均质器购自湖南某科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理。用均质器均质肉组织样本；称取（3.0±0.05）g均质物至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入6mL乙腈-0.1mol/L氢氧化钠溶液，涡动2min，4 500 r/min以上，室温离心5min；取出1mL上清液至15mL干净的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；加入1mL复溶液，用涡旋仪涡动1 min，然后取100 μL加入到 900 μL复溶液中，混匀；最后取50 μL 用于检测。

1.2.2 检测步骤。取出所需数量的微孔板，将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做两孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；加标准品或样本50 μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物（50 μL/孔），轻轻振荡、混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30 min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤液（250μL/孔），充分洗涤4～5次，每次间隔10s，倒出板孔内的洗涤液，用吸水纸拍干；加入底物液A液（50μL/孔），再加入底物液 B 液（50 μL/孔），轻轻振荡、混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15 min；加入终止液（50μL/孔），轻轻振荡、混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔的吸光度值（OD值）。

1.2.3 百分吸光率的计算。标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准品（0标准）的吸光度值的平均值,再乘以100%，即

式中：B——标准品或样本溶液的平均吸光度值；

B0——0μg/L标准溶液的平均吸光度值。

以标准品百分吸光率为纵坐标，甲羟孕酮标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中甲羟孕酮的实际浓度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 根据1.2.2步骤，分别测定浓度为0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μg/L 甲羟孕酮标准液的吸光度值，建立标准曲线。详见表1、图1和图2。

表1 标准曲线的ELISA测定

图1 甲羟孕酮标准曲线图

图2 标准曲线方程

试验表明，标准曲线的质量浓度范围在0.03～0.48μg/L，IC50（50%抑制浓度）为83.0μg/L；线性方程y=-2.1773x+1.5218，R2=0.9938。

2.2 检测限 对20份空白鸡肉和20份空白鱼肉样本进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光率的浓度。以20份样本甲羟孕酮浓度的平均值（x）和标准差（s）表示检测限（MDL），即 MDL=x+3s。结果显示，该酶联免疫法对鸡肉和鱼肉样本的检测限均为1μg/kg。

2.3 准确度和精密度 酶联免疫法的准确度用回收率表示，精密度用变异系数表示。在空白鸡肉和鱼肉样本中添加浓度为1、2、4μg/kg的甲羟孕酮，用3个批次的ELISA试剂盒进行回收试验，每个添加量做4个平行，结果见表2、表3。

表2 鸡肉样本精密度及准确度试验

表3 鱼肉样本精密度及准确度试验

从表2、表3可见，对鸡肉样品进行添加，甲羟孕酮的平均回收率在68.3%～94.6%之间；对鱼肉样品进行添加，其平均回收率在65.5%～93.2%之间；两个样本的批内、批间相对标准偏差（RSD）均小于10%。

2.4 交叉反应率试验 根据交叉反应率公式，计算得到甲羟孕酮试剂盒与甲地孕酮、孕酮、己烯雌酚、炔诺酮的交叉反应率均小于1%，说明该酶联免疫试剂盒的特异性较高。结果见表4。

表4 交叉反应率试验

2.5 仪器法比对试验 取50份鸡肉和鱼肉样本，用“SN/T 1625-2005进出口动物源性食品中甲羟孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的检测方法：气相色谱-质谱测定方法”进行仪器对比试验，结果显示该仪器法的检测限为1μg/kg。表明本次试验所用试剂盒的检测结果和仪器法的检测结果是一致的。详见表5、表6。

表5 鸡肉样本的酶联免疫法和仪器法对比试验 μg/kg

表6 鱼肉样本的酶联免疫法和仪器法对比试验 μg/kg

3 结论

酶联免疫法对鸡肉和鱼肉样本的检测限均为1 μg/kg。当甲羟孕酮的添加浓度为 1、2、4μg/kg时，其平均回收率范围在65.5%～94.6%；交叉反应率试验表明该试剂盒的特异性良好；酶联免疫法与仪器法的验证结果一致。由于某些不可避免的人为误差，不同批次的ELISA试剂盒在制作过程中很难保证质量完全一致，而本试验所用甲羟孕酮检测试剂盒的批内、批间相对标准偏差均小于10%，重现性较好。该酶联免疫法的操作时间短，灵敏度较高，检测限低，不需要昂贵的仪器设备，操作方法较简单，因此适合现场大批量检测样本的快速检测。

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