庞磊　张跃蓉　刘忠林

[摘要] 目的 观察不同浓度的雌激素作用于体外培养的人胚髁突软骨细胞（MCCs），探讨雌激素对MCCs增殖分化的影响。方法 体外培养MCCs，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色法鉴定；甲基噻唑基四唑（MTT）法检测不同浓度雌激素对MCCs增殖与分化的影响。结果 高浓度（10-6 mol·L-1）、低浓度（10-12 mol·L-1）雌二醇抑制MCCs增殖分化，生理浓度（10-10、10-8 mol·L-1）雌二醇促进MCCs增殖分化，且随作用时间延长，促进或抑制作用增强。结论 雌激素对体外培养的人胚MCCs增殖分化具有双向调节作用，呈时间和剂量依赖性。表明雌激素对维持颞下颌关节的正常功能具有重要意义，可能在颞下颌关节病的发生和进程中发挥作用。

[关键词] 髁突软骨细胞； 雌激素； 增殖； 人胚

[中图分类号] Q 254 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.020

颞下颌关节紊乱病（temporomandibular joints disorder，TMD）是口腔颌面部常见病、多发病，病因复杂[1-2]。流行病学调查显示，其发病存在明显的性别差异，以女性高发，且患病集中在青春期和绝经期[3-4]，推测雌激素与TMD的发病可能有一定关系。髁突软骨细胞（mandibular condylar chondro-cytes，MCCs）具有类似间充质细胞的作用，其增殖分化直接调节细胞外基质的合成与降解。既往动物实验表明，雌激素影响长骨和颞下颌关节软骨的增殖分化[5-7]，而探究雌激素对人MCCs作用的报道甚少。本研究选用17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）干预体外培养的人胚MCCs，从而了解雌激素对人胚MCCs生长代谢的影响，为进一步揭示雌激素与TMD的作用机制提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料、试剂及仪器

1.1.1 标本 选取遵义医学院附属医院计生科提供的因母体健康原因水囊引产并自愿捐献的4～5月龄胚胎。实验通过伦理委员会批准和同意。

1.1.2 实验试剂和仪器 鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体、通用型二步法免疫组化检测试剂盒、山羊血清封闭液、胃蛋白酶消化液、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），改良的高糖Eagle培养基（high glucose Dulbeccos modified Eagle medium，HG-DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），Ⅱ型胶原酶、E2（Sigma公司，美国），胎牛血清（fe-tal bovine serum，FBS）（Hyclone公司，美国）。

倒置相差显微镜（IX71）、Image-Pro Express6.0成像系统（Olympus公司，日本），二氧化碳培养箱（Forma公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 人胚MCCs的原代培养与纯化 无菌条件下取出双侧髁突，仔细剥离去除髁突软骨表面的纤维组织，切取呈半透明的软骨中间部分，PBS清洗，反复剪切至1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃振荡消化30 min；37 ℃ 0.1%Ⅱ型胶原酶消化2 h，150目筛网过滤，用含20%FBS的HG-DMEM调整细胞浓度至每毫升5×105个，然后接种于25 cm2培养瓶中培养，观察并记录细胞生长状况。生长至第8天时，差速贴壁3次去除成纤维细胞，纯化后计数细胞浓度为每毫升5×105个时接种于25 cm2培养瓶中。

1.2.2 人胚MCCs传代培养及细胞爬片制备 原代细胞达到70%～80%融合时，胰蛋白酶消化收集细胞，用含10%FBS培养基制成浓度为每毫升5×105个的细胞悬液接种于25 cm2培养瓶，每3 d更换1次培养液。收集第1代细胞，加培养基调整细胞浓度为每毫升

5×104个，接种于已预先放置灭菌处理盖玻片的六孔板中。细胞60%融合时，固定于载玻片上。4%预冷丙酮中固定15 min，PBS漂洗，4 ℃保存备用。

1.2.3 人胚MCCs的形态学观察 取已制备好的MCCs爬片，PBS漂洗，苏木精染色4 min，1%盐酸乙醇分化2 s，流水冲洗，温水返蓝后，伊红复染3 min，常规脱水、透明后中性树胶封固。

1.2.4 人胚MCCs的鉴定 1）甲苯胺蓝染色：PBS漂洗细胞爬片，0.1%甲苯胺蓝染色15 min，水洗10 min，常规脱水、透明后中性树胶封固。2）Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色：在细胞爬片上，滴加0.3%Triton-X100作用20 min；再滴加3%过氧化氢避光孵育15 min，胃蛋白酶室温消化20 min，山羊血清室温封闭30 min；滴加鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体（一抗），对照组加PBS，4 ℃过夜；次日，滴加通用型二抗50 μL，37 ℃孵育30 min；DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗，常规脱水透明后封固。

1.2.5 绘制人胚MCCs的生长曲线 收集第2代单层软骨细胞，细胞浓度为每毫升2×104个，每孔1 mL接种于24孔培养板。每日随机取3孔，每孔计数3次，取3孔细胞数平均值作为计数结果，连续计数8 d。

以时间为横轴，细胞浓度为纵轴，绘制细胞生长曲线，分析第2代细胞的生长情况。

1.2.6 雌激素对人胚MCCs增殖分化的影响 依E2浓度的不同将实验分为5组，分别为10-12 mol·L-1组、10-10 mol·L-1组、10-8 mol·L-1组、10-6 mol·L-1组、0 mol·L-1（乙醇溶剂对照组），实验前用培养基将E2稀释成所需浓度。取对数生长期的第2代MCCs，制成浓度为每毫升5×104个的细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μL，并将96孔板周边的36孔用灭菌PBS填充，培养24 h，进行同步化处理，抽去旧培养基，换不含血清的培养基培养24 h。抽去培养基，每孔加入200 μL不同浓度的E2，每组设9个复孔，加药后继续培养24、48、72 h，实验组每孔加入甲基噻唑基四唑（methyl thiazdyl tetrazolium，MTT）（5 mg·mL-1）20 μL，37 ℃继续孵育4 h，吸去上清液后，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床振荡10 min，充分溶解结晶物。在预热后的酶标仪上选择波长490 nm，测定各孔光密度值（optical density，OD）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行处理，所得实验数据以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，并用LSD方法进行多重比较。

2 结果

2.1 原代人胚MCCs的形态

原代细胞接种1 d后完成铺伸；接种第5天细胞相互融合，密度为40%；接种第7天细胞伪足伸长，相连成片，成簇聚集，细胞密度达50%；接种第13天细胞排列紧密，融合达到80%（图1）。

2.2 传代人胚MCCs的形态观察

原代细胞培养至12～13 d第1次传代。传代培养的MCCs接种后6～8 h开始贴壁，第3～5天快速增殖，呈铺路石状（图2左），细胞伸出伪足相互融合，第7天细胞密度达到80%（图2右）。

2.3 人胚MCCs的苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，

HE）染色结果

人胚MCCs主要呈三角形、多角形，细胞质均匀丰富，染成浅红色；细胞核呈圆形、椭圆形，染成浅蓝色，偏向细胞一侧，可见1～2个染成深蓝色的核仁（图3）。

2.4 人胚MCCs的鉴定结果

甲苯胺蓝染色后，细胞质内可见均匀的紫蓝色异染基质，细胞核染成深蓝色，结果为阳性（图4左）。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色后，细胞质中可见片状或团块状棕黄色颗粒，细胞核复染为蓝色，结果阳性，阳性率达95%（图4右）。

2.5 第二代人胚MCCs的生长曲线

传代1 d后MCCs重新贴壁，生长缓慢，少数细胞未能贴壁生长，细胞数目有损失，细胞生长处于起始期；第2天开始，细胞适应生长环境，进入快速增殖期；第3～4天细胞生长速度极快，细胞数目成倍增长，生长曲线陡然上升，细胞生长处于对数期；第5～7天增殖速度减慢，第8天细胞增殖趋于平缓，进入平台期（图5）。

2.6 雌激素对MCCs增殖分化的影响

雌二醇对MCCs增殖分化的影响见表1。MTT法比色结果显示：10-6 mol·L-1组、10-12 mol·L-1组作用后OD值均低于对照组（P<0.05），且10-6 mol·L-1组OD值明显低于10-12 mol·L-1组（P<0.05），表明高浓度与低浓度E2均可抑制髁突MCCs的增殖与分化，高浓度抑制作用更强。10-10 mol·L-1组、10-8 mol·L-1组作用后OD值均高于对照组（P<0.05），且10-8 mol·L-1组OD值高于10-10 mol·L-1组（P<0.05），表明相当于生理浓度的E2可促进细胞的增殖分化，且10-8 mol·L-1 E2促进作用最强。E2作用48、72 h，10-6 mol·L-1组OD值持续下降（P<0.05），作用72 h降至最低（P<

0.05）；对照组OD值持续升高（P<0.05），72 h达到顶峰（P<0.05）；作用48 h，10-12 mol·L-1组OD值低于对照组（P<0.05），高于加药后24 h同浓度组，但差异无统计学意义，表明该浓度作用48 h抑制软骨细胞生长，抑制作用并未完全抵消细胞对数生长期的增殖活力，到72 h OD值明显下降（P<0.05），随作用时间的延长，低浓度E2抑制了髁突软骨细胞的增殖分化。以上结果表明，E2对髁突软骨细胞增殖分化的影响随作用时间的延长，效应更显著。

3 讨论

TMD病因复杂，几乎所有与颞下颌关节的组成结构、咀嚼肌系统、邻近组织的改建、骨关节的炎性病变等相关的因素都有可能诱发TMD[1]。临床资料显示女性TMD患病率明显高于男性，女性患病年龄集中在15～20岁和45～55岁，这两个年龄段分别与青春期、绝经期吻合[4]。TMD存在性别和年龄的差异，提示雌激素与TMD有关，其水平的高低变化可能会影响TMD的进程。

雌激素是类固醇激素，分泌入血后与性激素结合球蛋白可逆性结合，游离的雌激素扩散到靶组织中发挥其广泛的生物学效应[8]。研究[9-10]发现大鼠颞下颌关节中存在有雌激素受体的表达。Wang等[11]进一步提取到了体外培养的大鼠颞下颌关节MCCs的雌激素受体总蛋白，从而证明颞下颌关节是雌激素作用的靶器官，雌激素受体可介导雌激素对颞下颌关节的作用[12]。

以往国内外学者主要在动物模型上探讨雌激素对软骨细胞代谢的影响，Talwar等[13]证实10-8 mol·L-1雌二醇可抑制大鼠对数期髁突软骨细胞增殖，促进肥大软骨层Ⅹ型胶原的合成分泌，使得软骨细胞外基质厚度增加，软骨细胞层数减少，影响髁突软骨发育成熟。Yun等[6]发现不同浓度雌激素可诱导大鼠髁突软骨不同炎性细胞因子的表达，导致关节炎发生。邵乐南等[14]研究发现高浓度（10-6 mol·L-1）雌二醇对兔的髁突软骨细胞增殖有显著地抑制作用，生理浓度（10-10～10-8 mol·L-1） 雌二醇促进软骨细胞增殖，其最大效应也是在浓度为10-8 mol·L-1。张旻等[15]的研究却显示出不同的结果，高浓度（10-6 mol·L-1）雌二醇对兔的髁突软骨细胞增殖具有促进作用。以上的研究都提示了雌激素水平的高低可影响髁突软骨细胞的代谢，从而影响软骨细胞外基质的合成与分泌，导致软骨层厚度的改变，进而引发TMD的骨关节炎性病变；但学者们就雌激素是促进动物髁突软骨细胞生长还是抑制其生长的问题上出现了分歧。为进一步查明雌激素对人类髁突软骨细胞增殖分化的影响，本实验采用体外分离培养人胚MCCs，不同浓度雌激素的干预实验，观察雌激素对人胚MCCs增殖与分化的影响，为进一步揭示雌激素与TMD的作用机制提供实验基础。

髁突软骨是纤维软骨，其软骨层细胞主要功能是合成和分泌Ⅱ型胶原[16]，目前基于软骨的组成多用酶消化法获取软骨细胞。本实验运用张跃蓉等[17]使用的改良两步酶消化法，胶原酶消化液用高糖培养基配制，这既增加组织块与酶的接触面积，充分发挥酶的消化作用，又减少了酶对游离细胞的损伤，并采用差速贴壁法消除成纤维细胞的污染，进而获得高活性、高增殖力均一的髁突软骨细胞。

细胞生长曲线的描述，准确反映了细胞的生长情况[18]，不同生长期的细胞特性不同，因此细胞生长周期的测定对于确定传代时间以及选择药物实验干预方案显得尤为重要。本实验观察到第2代髁突MCCs于接种后3～4 d进入对数生长期，细胞活力最旺盛；第6天开始，细胞相互接触产生接触抑制，数量相对稳定；之后细胞相互聚集，停止增殖，继续培养细胞内开始产生空泡，形态改变，直至脱落死亡；因此，根据细胞生长周期确定第二代MCCs生长的第3～4天为实验干预的最佳时期。

实验结果显示：高浓度（10-6 mol·L-1）、低浓度（10-12 mol·L-1）的E2抑制MCCs的增殖，其中高浓度抑制作用最强；生理浓度（10-10、10-8 mol·L-1） E2能促进MCCs的增殖，10-8 mol·L-1 E2促进作用更强。随着雌激素作用时间的延长，E2对MCCs的促进及抑制作用加强；这与邵乐南等[14]的研究结果一致。综合流行病学资料，女性易发TMD，且患病集中在青春期和绝经期相，因此，笔者推测雌激素对人MCCs增殖分化作用并不是单纯的促进或抑制，而是具有双向调节作用，并呈现出时间、剂量的依赖性，即生理浓度雌激素促进髁突软骨的增殖，对维持颞下颌关节软骨基质代谢的平衡和正常功能具有非常重要的作用；而高浓度、低浓度雌激素均抑制髁突软骨增殖，使髁突软骨代谢失衡，从而引发骨关节炎性病变，导致TMD的发生。

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（本文编辑 杜冰）