范慧宁，陈尼维，沈伟琳

(1.苏州大学医学院，江苏苏州 215123;2.上海交通大学附属第六人民医院消化内科，上海 200233)

流行病学研究显示，急性胰腺炎的发病率呈明显上升趋势，但有关发病机制尚未完全明了。近年来，有研究发现，H2S具有多种生理功能，与气体分子NO、CO在部分生物学功能方面相似。因此，它被看作体内第三种的气体信号分子［1］。多项基础研究表明，H2S与多种疾病的发病过程有着密切的关系，尤其在组织损伤中起着重要的作用［2］。本研究通过对H2S在大鼠急性重症胰腺炎相关的实验研究，以期探讨H2S对急性胰腺炎组织损伤的机制及影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

健康雄性Winstar大鼠160只，SPF级，体质量200～300 g。购自西普尔-必凯实验动物有限公司。L-精氨酸(L-Arg)、PAG，分析纯级，购自鼎国，日本进口分装。醋酸锌、对苯二胺盐酸盐、三氯醋酸、NaHS，分析纯级，购自 Sigma。大鼠淀粉酶(Amylase)ELISA试剂盒(美国进口分装)，RT-PCR试剂盒(Thermo scientific公司，Takara公司)。

1.2 实验分组

大鼠随机分四组:对照组，n=40;SAP组，n=40;SAP+NaHS组，n=40;SAP+PAG 组，n=40;NaHS为 H2S的供体，PAG 为胱硫醚-γ-裂解酶(CES)抑制剂;另两组注入等体积生理盐水作对照。每组随机分为四小组，分别对应3、12、24、36 h 4个时间点，每小组n=10。饲养环境为清洁级，自由饮水，光/暗12 h循环。

1.3 模型制备

实验采用分次大剂量L-Arg腹腔内注射致大鼠SAP模型［3-4］，实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。SAP组、SAP+NaHS组及SAP+PAG组大鼠分2次腹腔内注射20%L-Arg(剂量1.6 g/kg)，中间间隔1 h，对照组同法注射等量的生理盐水。SAP+NaHS组，术前5 d起每日一次性向腹腔内注射NaHS(剂量56 μmol/kg);SAP+PAG组，造模前5 d起每日一次性向腹腔内注射PAG(剂量45 μmol/kg);另两组注入等体积生理盐水作对照。

1.4 数据采集

1.4.1 血清H2S含量测定 于末次注射L-Arg后3、12、24、36 h4 个时间点，采用去蛋白的方法测定血清中H2S含量。用分光光度计在670 nm处检测吸光度。根据H2S标准曲线计算上清液中H2S的含量(单位:μmol/L)。

1.4.2 血清淀粉酶含量测定 本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。在450 nm处测OD值，淀粉酶度OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中淀粉酶浓度。

1.4.3 病理学检查 经过4%多聚甲醛固定的胰腺组织，石蜡包埋后切片，苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，光学显微镜下观察，按积分评定标准进行胰腺组织形态学检查及镜下胰腺组织损伤定量评估。

组织获取与制片:取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4 μm切片;切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗;常规脱水，透明，封片。

Grewal法对胰腺组织损伤进行定量评估:

水肿:0分=无水肿;1分=轻度叶间隙增宽;2分=重度叶间隙增宽;3分=腺泡间隙增宽;4分=细胞间隙增宽。

坏死:0分=无坏死;1分=坏死面积1%～10%;2分=坏死面积11%～20%;3分=坏死面积21%～30%;4分=坏死面积＞30%。

1.4.4 胰腺组织CSE含量变化测定 剩余胰腺组织作匀浆，real-time PCR法测定胰腺组织中CSE含量变化。引物:由Invitrogen合成

CSE-forward:AGCGATCACACCACAGACCAAG

CSE-reverse:ATCAGCACCCAGAGCCAAAGG

beta-actin-forward:AGGCCAACCGTGAAAAGATG

beta-actin-reverse:ACCAGAGGCATACAGGG ACAA

实验方法:在大鼠胰腺组织中提取RNA，按试剂盒Rever Aid First-Strand cDNASynthesis Kit(Thermo scientific公司)说明书进行进行反转录，并以反转录为模版进行PCR扩增，反转录反应条件:37℃ 15 min(反转录反应)，85℃ 5 sec(反转录酶的失活反应)。两步法PCR扩增按试剂盒SYBR Green qPCR Super Mixture(Takara公司)说明书进行，标准程序:Stage 1:预变性，Reps:1，95℃ 10 s，Stage 2:PCR 反应，Reps:45，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，Dissociation Stage。

1.5 统计分析

2 结 果

2.1 病理结果

对照组胰腺组织细胞正常，见图1。其余三组胰腺间质不同程度水肿、充血，小叶间隙、腺泡间隙及细胞间隙增宽，不同程度的出血、坏死及炎性细胞浸润，证实为胰腺炎，Grewal病理评分结果，见表1。

表1 Grewal胰腺病理损伤评估Tab.1 Grewal pancreatic pathological damage assessment

各组在不同时间点的病理表现见图1、2、3、4。HE染色结果作平行比较，与 SAP组比，SAP+NAHS组较早出现水肿、弥漫性胰腺细胞坏死及炎细胞浸润且比较严重;SAP+PAG组则较晚出现炎性表现，未见明显坏死，胰腺组织损伤较轻。NaHS对胰腺组织有明显的加重损伤作用，而PAG则能够减轻胰腺组织损伤。这与实际取样时目测结果基本一致。

图1 对照组大鼠胰腺组织病理切片(×200)Fig.1 The pathological changes of pancreatic tissue in the normal control group at different time points

图2 SAP组大鼠胰腺组织病理切片(×200)Fig.2 The pathological changes of pancreatic tissue in SAP group at different time points

图3 SAP+NaHS组大鼠胰腺组织病理切片(×200)Fig.3 The pathological changes of pancreatic tissue in SAP+NaHS group at different time points

2.2 血清淀粉酶及H2S含量变化

3、12、24、36 h 4个时间点各组大鼠血清淀粉酶与H2S含量的时相性变化见表2;血清淀粉酶含量统计图见图5;血清H2S含量统计图见图6。各组各时间段之间比较，差异均有显著性(P＜0.05)。

表2 各组大鼠胰腺淀粉酶及H2S含量变化Tab.2 Comparison of serum amylase and H2S levels in each group at different time points

图5 血清淀粉酶时相性变化柱状图Fig.5 The histogram of phasic changes of serum amylase

图6 血清H2S时相性变化柱状图Fig.6 The histogram of phasic changes of serum H2S

淀粉酶含量结果显示:SAP组血清淀粉酶较之正常组有明显的上升;预先腹腔注射NaHS后加重了这种趋势，尤其在12 h处出现一个较高的淀粉酶值;而预先腹腔注射PAG则抑制了淀粉酶的升高。

H2S含量变化显示:SAP组H2S含量有较明显的上升;SAP+NaHS组从3 h开始即有一个较高的H2S数值;SAP+PAG组H2S含量相对而言较低值，且随时间变化缓慢上升。

2.3 胰腺组织CSE含量变化

3、12、24、36 h 4 个时间点各组大鼠胰腺组织CSE表达的ΔCT计算值，见表3。各组各时间段之间比较，差异均有显著性(P＜0.05)。

以差值法，见图7与比值法，见图8分别计算ΔCT。从结果可以看出，随着时间的延长，SAP组胰腺中的CSE含量逐渐升高，NaHS的使用加快了这一趋势。SAP+PAG组CSE有显著降低，在12 h时，该组ΔCT近正常组的1倍。

表3 各组大鼠胰腺CSE表达ΔCT计算值Tab.3 Comparison of the ΔCT value in each group at different time points

图7 差值法计算ΔCT值Fig.7 The histogram of ΔCT value calculated by difference method

图8 比值法计算ΔCT值Fig.8 The histogram of ΔCT value calculated by ratio method

3 讨 论

近年来，研究表明，H2S在炎症引起的组织损伤中起着相应作用。而H2S在炎症性疾病中所起到损伤还是保护作用尚存在着不同结论，外源性H2S的促炎或抗炎作用可能与其配方，剂量与疾病模型有关［5-6］。此外，有研究发现H2S/CSE体系在急性重症胰腺炎发病时、其他脏器的组织损伤时发挥着重要作用。

本实验通过观察SAP模型，发现H2S与大鼠急性重症胰腺炎组织损伤之间有着明显的相关性。研究发现，随着时间延长，SAP组血清淀粉酶、H2S含量与组织中CSE含量显著升高(图7、8);与对照组差异有显著性(图5、6);并与组织损伤程度呈正相关(表1，图1、2)。在其他脏器的研究中发现，在损伤组织的细胞中H2S水平明显升高，可能与H2S能轻易透过细胞膜而抑制线粒体的呼吸活性，影响细胞的功能，加重炎症反应有关。

研究中还发现，SAP+NaHS组血清淀粉酶较SAP组有显著升高，在12 h处出现一个峰值，达到对照组的三倍左右(图5);血清H2S在早期即有一个比较高的含量(图6);CSE表达与SAP组无显著性差异(图7、8)。血清H2S的升高与病理损伤呈正相关，镜下见组织损伤更为严重，并比SAP组更早出现坏死和小叶结构破坏(表1，图2、图3)。研究数据表明，NaHS增加了血清H2S含量，并与组织损伤呈正相关，由此可以推断H2S在胰腺炎细胞损伤过程中可能起了一种促炎症反应的作用。陈尼维等［7］通过测定不同程度急性胰腺炎患者血浆H2S含量及上腹部CT扫描并按CTSI对胰腺炎损伤分级，发现血浆H2S可能是导致重症急性胰腺炎重要因素之一。Bhatia等［8］在研究中发现，NaHS在组织损伤诱导细胞的凋亡，且可能与增加细胞中P物质的产生，从而增加PPT-A和NK-IR的水平，由此加重组织损伤;以及引起胰腺腺泡细胞磷脂酰丝氨酸外化，刺激胱冬酶(caspase)-3、8、9活性，使线粒体膜能下降和细胞色素C的释放有关［9］。

SAP+PAG组与SAP组对照发现，预先腹腔注射PAG后，血清淀粉酶、H2S含量及组织CSE含量明显降低，其差异有显著性(图5～8)。病理结果显示，预先腹腔注射PAG后，显著延缓了水肿、坏死等胰腺组织损伤的出现，且在组织损伤出现后明显地减轻了出血、炎症细胞浸润等表现，Grewal胰腺病理损伤评估证实与SAP组有显著差异(表1，图4)。上述结果表明，PAG能够明显降低CSE的表达，通过降低血清H2S含量，而减轻了组织损伤，此结果支持关于H2S在胰腺炎细胞损伤过程中可能起促炎症反应作用的推断。可能与腺泡细胞中P物质-神经激肽-1受体(SP-NK-1R)相关途径有关。相应的在体实验也显示，给予外源性PAG可有效降低AP小鼠体内血浆H2S、P物质水平、胰腺H2S合成酶活性及胰腺、肺组织P物质浓度和NK-1R mRNA表达，说明H2S可能通过SP-NK-1R途径在胰腺炎中促进了炎症及组织损伤的发生［10，11］。

研究结果显示，大鼠重症急性胰腺炎血清H2S含量及组织中CSE表达显著高于正常组，且与组织损伤程度呈正相关;SAP+NaHS组血清H2S含量显著高于对照组，组织损伤亦有显著差异;SAP+PAG组，血清H2S、CSE的表达显著低于对照组，组织损伤定量评分亦显著降低。由此认为血清H2S在大鼠急性重症胰腺炎组织损伤程度中可能是重要参考指标，H2S含量在大鼠急性重症胰腺炎组织损伤中起着重要的作用。本实验结果提示了H2S有着加重大鼠SAP组织损伤的促炎作用，而PAG对组织损伤有着一定的保护作用，但PAG在人重症胰腺炎中是否有类似保护作用有待进一步研究。

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