许淑敏，李红强，鄂红玉，林闽加，程婷婷，白建文

(同济大学附属东方医院急危重病科，上海 200120)

随着老龄化进程的加剧，高龄患者(＞80岁)是目前面对的巨大群体，肺炎又是高龄人最常见的感染性疾病。随着年龄增长，肺炎导致的死亡率逐年增高，且花费的医疗费用高昂。高龄肺炎患者在重视抗菌药物合理治疗的同时更应强调全身综合治疗，包括免疫调节治疗。Toll样受体作为固有免疫系统中的细胞跨膜受体及模式识别受体之一，可以识别多种病原相关分子模式，从而合成多种炎症介质。TOLL样受体位于中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞等多种免疫细胞上。在动物实验中，研究得较清楚的是 TLR4与 LPS(Lipopolysaccharide，LPS)介导的途径，但是在临床肺炎研究中几乎为空白。本研究对高龄肺炎患者中性粒细胞TLR4表达之间关系进行了初步研究。

1 资料与方法

1.1 分组

1.1.1 肺炎组 选择2011年3月至2012年12月入住上海市东方医院急危重病科的社区获得性肺炎患者为研究对象。参照中华医学会呼吸病分会2006年制定的《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》［1］诊断标准入选患者，并且进行 PSI评分［2-3］。

剔除标准:有明确肿瘤病史;长期服用激素、免疫制剂史及免疫缺陷史。

将49例高龄肺炎患者按肺炎严重程度评分系统评分后进行分组，年龄(直接记分，如80岁，直接计80分)、性别(男性不加不减，女性减去10分)、护理机构人员(+10分)、充血性心力衰竭(+10分)、肿瘤(+30分)、肝脏疾病(+20分)、脑血管疾病(+10分)、肾脏疾病(+10分)、精神状态改变(+20分)、呼吸频率≥30次/min(+20分)、收缩压＜90 mmHg(+20分)、体温＜35℃或≥40℃(+15分)、脉搏≥125次/min(+10分)、血气分析pH＜7.35(+30分)、PO2＜60 mmHg(+10 分)、血尿素氮≥11 mmol/L(+20分)、血钠＜130 mmol/L(+20 分)、血糖≥14.0 mmol/L(+10 分)、血细胞比容＜30%(+10分)和胸腔积液(+10分)。年龄加上其余19个参数算出总分。将所有患者按照总分50、51～70、71～90、91～130和 ＞130分别为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级和Ⅴ级［3］。按Ⅰ～Ⅲ级、Ⅳ级、Ⅴ级分别划为低、中、高危组。经医院医学伦理委员会审批同意，受试者均签署知情同意书。

肺炎组49例:男性23例，女性26例，年龄(84.778±4.577)岁。合并症:慢性支气管炎8例，合并心功能不全2例，合并高血压病15例，合并脑梗死10例。

1.1.2 对照组 健康对照组:社区敬老院自愿者21例。

其中女性12例，男性9例;年龄(84.111±3.655)岁;合并症:高血压8例、脑梗死4例、慢性支气管炎5例。受试者均签署知情同意书。

肺炎组及对照组年龄、性别、合并症无统计学差异，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 中性粒细胞提取［4］肺炎组患者入院后次日抽取外周静脉血10 ml，肝素抗凝;抽取的抗凝血在3 h内分离获得中性粒细胞。10 ml静脉血置于50 ml离心管中，加入同体积的6%Dextran-40溶液(生工生物)室温下静置45 min。在另一50 ml离心管中加入10 ml淋巴细胞分离液(上海华精生物科技有限公司)，用1 ml的吸管吸取富含中性粒细胞的上清液后，缓慢沿管壁加在淋巴细胞分离液的液面上。4℃ 200×g离心30 min;吸去上部液体和单个核细胞，仅留下沉淀的中性粒细胞与红细胞。加入200 μl 1×PBS，加入9倍体积的0℃氯化铵溶液充分混匀，室温静止5 min溶解残存的红细胞，1 500 r/min，4℃ 10 min离心;吸去上清，离心管底部即为中性粒细胞，加入1×PBS 1 ml悬浮管底沉淀的中性粒细胞，转移到1.5 ml EP管中，2 000 r/min，4℃离心 5 min，吸取上清液;加入Trizol 500 μl，－80 ℃保存。

1.2.2 中性粒细胞纯度检测 提取的中性粒细胞行瑞士染色，见图1。CD15(BioLegend)标记中性粒细胞行流式细胞检测百分比(94.90±4.120)%。

1.2.3 TRIzol法提取 RNA，RNA 浓度检测

1.2.4 cDNA 模版的合成 取1 μg样本 RNA;加入1 μl oligo dT，再加水10 μl;72 ℃变性5 min，4 ℃迅速冷却;再加入 MLV RT buffer 5 μl，10mMdNTP 1.25 μl，40 U/μl 的 RNase inhibitor 0.625 μl，200 U/μl d MLV 酶 1 μl;再加入 7.125 μl 的水;42℃ 1 h，－20℃保存备用。

1.2.5 实时定量-PCR 将cDNA模版稀释10倍后备用;一个real-time PCR反应体系包括:水1 μl，1 μM 的正向引物 1.5 μl，1 μM 的反应引物 1.5 μl，SVBR Master Mix5μl，模板 cDNA 2 μl;在 AB Ⅰ7900 HT实时定量PCR仪上，按照默认的反应程序进行反应。实验所检测的基因及其引物包括(由上海生工生物工程技术有限公司合成):

TLR4

Forward Primer 5'-ACCTGAGCTTTAATCCCCTGA-3'

Reverse Primer 5'-GGCTCTGATATGCCCCATCTT-3'

GAPDH

ForwardPrimer 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3”

Reverse Primer5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 外周血中性粒细胞TLR4mRNA相对表达量

以GAPDH为内参，基因相对表达量采用2－△△CT方法计算［5］，肺炎组中性粒细胞TLR4mRNA相对表达量较对照组增高，P=0.008;两组存在显著差异，有统计学差异(表1、图2)。

2.2 肺炎组 PSI评分与肺炎患者中性粒细胞TLR4mRNA相对表达量相关性

根据PSI评分标准:其中年龄直接记分(80岁记80分)，女性患者减去10分，入组患者均为大于80岁的高龄患者，PSI评分均大于70分，均进入Ⅲ级及以上分组。通过PSI评分与中性粒细胞TLR4mRNA相对表达量进行分析，PSI评分越高，TLR4mRNA相对表达量越高，两者存在正相关，偏相关系数 r=0.495，P=0.001，见表 2、图3。

图1 瑞士染色中性粒细胞Fig.1 Switzerland staining neutrophils

图2 外周静脉血中性粒细胞TLR4mRNA相对表达Fig.2 The peripheral blood neutrophils TLR4mRNA relative expression

表1 外周静脉血中性粒细胞TLR4 mRNA相对表达量Tab.1 The relative expression of TLR4 mRNA in peripheral blood neutrophils (±s)

表1 外周静脉血中性粒细胞TLR4 mRNA相对表达量Tab.1 The relative expression of TLR4 mRNA in peripheral blood neutrophils (±s)

分组 TLR4 P值对照组 0.024±0.018肺炎组 0.042±0.026 0.008

表2 高龄肺炎患者中性粒细胞TLR4mMRA相对表达量与PSI评分相关性Tab.2 Correlation of neutrophil TLR4 mMRA relative expression with PSI score in elderly patients with pneumonia

图3 高龄肺炎患者中性粒细胞TLR4mMRA相对表达量与PSI评分相关性散点图Fig.3 Scatter diagram of correlation of neutrophil TLR4 mMRA expression with PSI score in elderly patients with pneumonia

3 讨 论

肺炎是临床最常见的疾病之一，在老年人群中更为常见。老年人免疫力随年龄的增长而逐渐降低，且常存在多种疾病，合并不同程度的营养不良，低蛋白血症等，这些都直接或间接地增加老年社区获得性肺炎患者病史率［6］。高龄肺炎患者有其特殊性，往往合并多种慢性基础疾病。高龄患者罹患社区获得性肺炎时部分以其他系统疾病症状来就诊，容易延误诊断。高龄患者肝肾功能减退，对于药物排泄降低，常规应用抗菌药物可能会加重肝肾功能损害。高龄肺炎患者痰液培养结果革兰阴性杆菌占59.3%，主要为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌;革兰阳性球菌占36.8%，主要为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌。这种病原菌分布的变化主要与近年来有创通气应用的增加，长期广谱抗生素的应用，反复多次住院，侵袭性操作等有关［7-8］。

中性粒细胞是重要的固有免疫细胞［9］，处于机体抵抗微生物入侵、特别是抵抗化脓性细菌入侵的第一线。目前，随着研究深入，已经认识到中性粒细胞结构复杂功能多样并具有强大的合成功能，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。很多肺部疾病都是以中性粒细胞主导的炎症反应为特征，如肺炎等气道管壁及肺组织中有大量中性粒细胞存在。中性粒细胞作为免疫细胞在杀灭细菌中起了非常重要的作用，其表面含有丰富的Toll样受体。Toll样受体作为先天性免疫的病原模式识别受体(pattern recognition receptors，PAMPs)，能够识别多种病原微生物抗原成分，介导跨膜信号转导，在免疫反应的激活中起重要的作用。至今人类发现10种TLRs。TLR是I型跨膜蛋白，胞外区富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeat，LRR)，胞内结构与白介素1-受体的胞内区相似，称为 TIR区(TLR/IL-R1 homologous region)［10-11］。TLRs 胞外区 LRR 类域包括19-25串联重复，每个重复有24-29个氨基酸的长度。LRR通过 PAMPs识别多种微生物［12-13］。TLR2识别多种配体如细菌脂肽，脂磷壁酸(LTA)［14］。TLR3 识别双链 RNA［15］。TLR4 能识别多种配体:以脂多糖(LPS)受体最为常见［16］。TLR5识别革兰阴性菌鞭毛保守结构域的蛋白［17］。TLR7/TLR8识别单链RNA［18］。TLR9识别非甲基化的CpG DNA［19］。TLRs识别配体后，信号主要通过MYD88依赖型和MYD88非依赖型2条途径传入细胞内。对MYD88依赖途径研究较清楚。主要是TLR4与LPS途径，最终通过转录因子NF-κB的活化，从而转录、翻译合成IL-1、IL-8、TNF-a等细胞因子杀伤病原体，抵抗外来病原微生物入侵。

本实验入组的70例高龄人中，通过抽取外周静脉血提取中性粒细胞，采用实时定量-PCR均检测到TLR4mRNA相对表达，证实TLR4在中性粒细胞有基本表达。在49例高龄肺炎患者中TLR4mRNA相对表达量较对照组表达量明显增高，统计学差别有意义。美国胸科协会(ATS)和美国感染病协会(IDSA)于2007年制定了《社区获得性肺炎诊断和治疗指南》，推荐用PSI以及CURB-65评分对病情及预后进行评估［20］。其中CURB-65评分简便适用于门诊患者，PSI评分系统比较全面，更适合于入院患者，包括3个人口学数据、5种合并的基础疾病、5项体格检查和7项实验室数据。不仅可以评价肺炎严重程度指数，还可以结合患者的基础疾病做出综合评价。PSI评分越高，机体炎症反应越强烈，预后越差，死亡率越高。本研究入组的49例高龄肺炎患者中，PSI评分均大于 70分，PSI评分越高，TLR4mRNA相对表达量越高，通过直线相关分析，TLR4mRNA相对表达量与肺炎严重度成正相关，有统计学意义。表明TLR4传到通路在高龄肺炎发病中起到一定作用。

革兰阴性菌细胞外膜层的主要成分是脂多糖(LPS)，它可以激活巨噬细胞等引起炎症介质的释放。LPS被释放后，在血液中与血清中的LPS结合蛋白形成复合物。后者与中性粒细胞、单核细胞表面的膜性CD14相互作用，再与TLR4结合，触发细胞内的信号传递，其中 Toll样受体可识别多种PAMPs，通过刺激信号的级联反应诱导炎症介质的产生，在肺部感染的炎症反应中起重要作用。对TLR的研究有助于深入对感染性疾病的发生发展过程的认识，更重要的是，为抗感染治疗，特别是重症感染的治疗提供了新的思路，目前有关治疗的研究主要是针对TLR4，例如:CD14为TLR4的重要配体。CD14单克隆抗体通过下调TLR4介导的炎症反应，减少了小鼠因过度炎症反应所引起的脏器衰竭，最终有效降低死亡率［21］。临床资料表明，高龄肺炎患者以革兰阴性菌为主，结合动物实验研究，革兰阴性菌主要与TLR4传到通路密切相关;故本研究仅对于TLR4表达进行检测。本研究证实高龄肺炎患者中性粒细胞TLR4基因上调，但是未检测TLR家族其他亚型，未进一步对下游细胞因子进行检测，待进一步深入研究。

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