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苦马豆中总生物碱的提取工艺研究*

2013-12-11李能莲舍雅莉王雅莉骆亚莉胡树名杨扶德

中医研究 2013年11期
关键词:正丁醇生物碱甘肃

张 立,李能莲,舍雅莉,王雅莉,陈 丽,骆亚莉,胡树名,杨扶德

(甘肃中医学院国家中医药管理局中药生药三级科研实验室,甘肃兰州730000)

苦马豆为豆科苦马豆属植物苦马豆Swainsonia salsula Taubert.的带根全草,具有补肾、固精、利水等功效,为甘肃、宁夏、青海等地民间常用药,常被用来治疗阳痿、遗精、白带及小便不利等,民间药物名为“马皮泡”“尿泡草”“铃当草”“羊卵泡”“红苦豆子”。民间常用苦马豆素(Swainsonine,SW)治疗肾炎水肿、慢性肝炎、肝硬化腹水等,具有悠久的应用历史[1]。苦马豆素具有很强的抗肿瘤、抗辐射及免疫增强活性,作为一种崭新的抗肿瘤药物,已引起了极大关注,是当前研究的热点[2]。苦马豆素是从苦马豆中提取的吲哚兹定生物碱,分子结构是吲哚兹定环的1,2,8 位上各有 1 个羟基,化学名为 1,2,8-三羟基八氢吲哚兹定,属于醇类,又被命名为吲哚兹定三醇。苦马豆素的提取是采用对样本酸化、碱化后从小极性溶剂到大极性溶剂分别萃取,再经离子交换柱或硅胶柱层析从中分离苦马豆素[3]。这种方法提取周期长、步骤繁琐,有待于进一步改进。此外,也有人工合成苦马豆素的报道[4],但方法步骤过多、产率低、不适于批量生产。本研究在前人研究的基础上,采用3种不同工艺提取苦马豆中总生物碱,并比较总生物碱得率,探索一种经济简便、可用于苦马豆素批量生产的提取分离工艺,为苦马豆素的开发利用提供基础。

1 药品与试剂

苦马豆 Swainsonia salsula Taubert.地上部分,2011年8月采集于甘肃省古浪县张家湾,由甘肃中医学院杨扶德教授提供并鉴定。自然干燥,粉碎,阴凉处保存备用。750,850,950 g/L乙醇及碘化铋钾试剂,均由利安隆博华(天津)医药化学有限公司提供;化学试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 乙醇回流提取及总苦马豆碱含量测定

此为第1种工艺。准确称取苦马豆干草粉3份,各5 g;分别经750,850,950 g/L乙醇回流提取3次,每次2 h;水浴挥去乙醇至浸膏;2 mol/L HCl溶解后过滤得酸水液;3 000 r/min离心15 min得上清液;弃去固体杂质;用氨水调水相pH值至9~10;正丁醇萃取6~8次挥去正丁醇得总生物碱,称质量,测提取物含量。碘化铋钾试管反应为阴性停止萃取。实验重复5次。

2.2 超声提取及总苦马豆碱含量测定

此为第2种工艺。准确称取苦马豆干草粉4份,各5 g;分别用75 mL自来水浸泡苦马豆草粉12 h;置于59 kHz超声清洗器45℃,分别处理30,60,90,120 min,重复2 次,过滤得水液;水液置水浴锅上80℃浓缩到30 mL后,用2 mol/L HCL酸化;3 000 r/min离心15 min得上清液;弃去固体杂质;用氨水调水相pH值至9~10;正丁醇萃取6~8次后回收溶剂得总生物碱称质量,测提取物含量。碘化铋钾试管反应为阴性停止萃取。实验重复5次。

2.3 水提取及总苦马豆碱含量测定

此为第3种工艺。准确称取苦马豆干草粉5 g;加75 mL自来水浸泡过夜;常压下煮沸,每次1 h,共3次,过滤得水液;煮沸浓缩到15 mL;用2 mol/L HCl酸化过滤得酸水液;3 000 r/min离心15 min得上清液;弃去固体杂质;最后用氨水调水相pH值至9~10;正丁醇萃取6~8次后回收溶剂得总生物碱称质量,测提取物含量。碘化铋钾试管反应为阴性停止萃取。实验重复5次。

3 结果

见表1~3。

表1 不同提取方法生物碱出膏率对比

表2 不同处理间方差分析

表3 不同处理间差异显著性

通过表1~3结果分析:提取工艺1,2,3的总生物碱平均得率分别是6.641 9%、3.998 6%、1.311 6%。750 g/L乙醇回流提取总生物碱平均得率最高,与其他处理方法比较总生物碱平均得率差异显著及极显著(P<0.01);850 g/L乙醇与超声60 min、水煮处理间具有显著差异(P<0.05)。850 g/L乙醇提取的出膏率平行5次试验,差别较大,分析原因可能是工艺的可重复性较差,同时850 g/L乙醇提取的成分较为黏稠,对生物碱纯化不利。

4 讨论

苦马豆Swainsonia salsula Taubert.为豆科苦马豆属植物,在我国其资源丰富,对其提取物苦马豆素药用价值的发掘和研究方兴未艾。Colegate等[5]首次分离苦马豆素是用热乙酸乙酯索氏提取24 h,水溶部分上强酸性阳离子交换柱,收集稀氨水洗脱部分,浓缩后的残留物过药用琼脂糖凝胶柱,回收溶剂后重结晶,最后得到白色针状结晶。葛鹏斌等[6]分别从茎直黄芪和小花棘豆中分离出苦马豆素。童德文等[7]通过升华法和高效液相色谱从甘肃棘豆中分离得到苦马豆素纯品,得率为14.52μg/g。李勤凡等[8]采用萃取法改进了甘肃棘豆中苦马豆素提取工艺,但得率仅为5μg/g。上述方法提取周期长、步骤繁琐,实验成本高。

本次研究在条件相同的情况下,比较了乙醇回流、超声处理法和水煮法3种提取工艺对苦马豆中总生物碱得率的影响。水煮法在3种工艺中消耗成本最低,但苦马豆素总碱得率最低,且它要求物质的亲水性和热稳定性高,在萃取的过程中乳化现象严重,需要正丁醇萃取液长时间加热或静置离心以消除乳化现象,不适于批量生产。用超声提取中,将植物样品经水浸泡后采用超声技术处理(30,60,90,120 min)[9-13],但总碱得率较低,也不适于苦马豆素总碱的批量生产。3种提取工艺中,乙醇回流提取中总碱平均得率高于其他两种工艺,其中750 g/L%乙醇得率最高,周期短、易于操作,试验中的溶剂回收后可以重复利用,是目前提取苦马豆素的一种最为简便经济的工艺。游离的生物碱及生物碱盐都能溶于甲醇和乙醇,虽然甲醇的沸点低于乙醇且极性比乙醇大,对生物碱盐类的溶解性强于乙醇,但甲醇对人体的毒害较大、价格高于乙醇,故本实验使用乙醇作为溶剂。乙醇质量浓度设计在750~950 g/L,是因为苦马豆中生物碱种类较多,仅使用水或乙醇做溶剂不能完全提取,且苦马豆为草本植物,材料的吸湿性比较强,所以选择的物料比较大,在第一次浸提时加量较多。此与陈绍淑[13]、赵宝玉[14]的报道一致。在提取过程中发现:950 g/L乙醇提取的成分中所含色素多,测定生物碱之前需用石油醚除掉色素;850 g/L乙醇提取的成分较为黏稠,对生物碱纯化不利;750 g/L乙醇提取的成分数量较少,颜色淡。由此可见,如果需要色素可使用950 g/L乙醇做提取溶剂;如果节约成本,可使用750 g/L乙醇做提取溶剂。同时苦马豆素为大极性生物碱,根据相似相溶的原理,本研究在提取过程中对植物样品经酸化、碱化处理后,直接使用了大极性的正丁醇对碱水液中生物碱进行萃取,省去了常规先使用氯仿、乙酸乙酯等小中极性溶剂反复萃取的步骤。

[1]甘肃省卫生局.甘肃中草药手册[M].兰州:甘肃人民出版社,1973:1512.

[2]杨扶德,罗文蓉,林丽,等.苦马豆的生药学研究[J].中医药学刊,2003,21(9):1587-1588.

[3]吴旭锦,杨鸣琦,白春黎,等.苦马豆素的来源及分离方法进展[J].动物医学进展,2005,26(5):41-44.

[4]Gerres Heimgärtner,Dirk Raatz,Oliver Reiser.Stereoselective Synthesis of Swainsonines from Pyridines[J].Tetrahedron,2005,61:643-655.

[5]Colegate SM,Dorling PR,Huxtable CR.A pectroscopicinvestigation of swainsonine:an a-mannosidase inhibitor isolated from Swainsonia canecens[J].Aust JChem,1979,32:2257-2264.

[6]葛鹏斌,赵宝玉,童德文,等.小花棘豆中苦马豆素的提取分离与结构鉴定[J].中国农学通报,2003,19(1):1-3.

[7]童德文,曹光荣,李绍君.甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报,2001,29(3):5-8.

[8]李勤凡,王建华,刘志斌,等.萃取法提取甘肃棘豆中的苦马豆素研究初报[J].中国农学通报,2005,21(5):143-145.

[9]赵俊,童德文,税媛媛,等.甘肃棘豆草中苦马豆素的提取分离工艺比较研究[J].西北植物学报,2006,26(7):1459-1463.

[10]王铮敏.超声波在植物有效成分提取中的应用[J].三明高等专科学校学报,2002,19(4):45-53.

[11]郭孝武,吉晓芹.杜仲叶中总黄酮物质超声提取的研究[J].西北植物学报,2003,23(11):1984-1987.

[12]申金龙,孙良顺,李峰,等.钩藤中总生物碱提取工艺研究[J].安徽农业科学,2010,38(1):358-375.

[13]陈绍淑.小花棘豆生物碱系统分析及其活性研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2003.

[14]赵宝玉.疯草中生物碱系统分析及其毒性的比较病理学研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2001.

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