葛敏 蒋朝华 戴婷婷 程佳 李圣利

淋巴系统对于维持人体内环境的稳定、引流组织间隙的体液、免疫功能的发挥具有重要的意义，这些功能的发挥与淋巴管内皮细胞（Lymphatic endothelial cells，LECs）的功能密切相关。淋巴管生成（lymphangiogenesis）是在既存淋巴管基础上的淋巴管新生。在炎症及肿瘤过程中，淋巴管生成参与了组织的修复及肿瘤的转移[1-2]。这是目前淋巴学研究领域的重要内容，也是研究淋巴管畸形、淋巴水肿以及肿瘤转移等疾病的基础。LECs培养不易，成活和传代较困难，是目前亟需解决的问题。

本实验采用不同血清浓度的培养基培养LECs，探讨不同血清浓度对于LECs培养的影响，探索稳定、高效的LECs培养方法，为组织工程构建淋巴管的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

EGM-2-MV（Lonza 公司，美国）；DMEM-高糖（Hyclone公司，澳大利亚）；胰酶/EDTA消化液（Hyclone公司，澳大利亚）；胶原酶（Serva公司，德国）；中性蛋白酶 （Roche公司，美国）；流式抗体Podoplanin（eBioscience 公司，美国）；低密度脂蛋白Dil-Ac-LDL（Invitrogen 公司，美国）；metrigel（BD 公司，美国）；免疫荧光抗体podoplaningon（Angiobio公司，美国）；PCR 引物（捷瑞生物公司，中国）；CD31阳性磁珠(Dynal公司，美国)；纤维连接蛋白（Sigma公司，美国）；血清（Gibco 公司，美国）。

1.2 仪器设备

超净工作台（上海医疗器械公司）；CO2培养箱（GmbH公司，德国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；M-CBAD全自动显微照相机（Olympus公司，日本）；PCR仪（Biometra公司，德国）。

1.3 细胞分离和培养

经知情同意后，留取环切术幼儿包皮，彻底洗净，去除皮下疏松组织，中性蛋白酶结合胶原酶消化，CD31阳性磁珠分选获得CD31+细胞[3]。用完全内皮细胞培养基EGM-2重悬，计数，调整细胞密度至1×105cells/mL后，接种于用20 ng/mL纤维连接蛋白铺底的6孔板中培养。……