刘 萌，黄晓杰，马圆圆，赵卉双

（辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州121001）

乳蛋白肽是乳蛋白水解后的产物，具有独特的加工特性和多种生理特性，水解使埋藏在蛋白质内部的疏水性氨基酸残基暴露出来与味蕾接触，从而产生苦味。目前苦味肽的脱除方法主要有分离法、掩埋法和生物酶解法等[1]。近年来，使用肽酶来减弱或消除苦味的研究较多，但肽酶价格较高，尚未在食品行业中大规模使用。许多微生物存在一定的产酶系统，有能力将苦味肽进一步水解，使苦味下降甚至完全消失。微生物分布广、种类多、代谢旺盛、繁殖快，无疑给脱苦的产业化链条提供了一种可能。本实验拟通过筛选得到脱苦效果佳的菌株，并将其应用于乳饮料的脱苦。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒酵母干粉 大连工业大学提供；直投式冻干乳酸菌复合菌种（由嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌复合） 黑龙江八一农垦大学提供；土豆汁培养基 去皮切块土豆200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，调节pH至6.8，于121℃灭菌20min，培养24h镜检确定无菌生长后方可使用。

TGL-16G型高速离心机 上海安亭科学仪器厂；紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；PHS-3CW型精密酸度计 上海江仪仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳蛋白肽饮料制备工艺 牛乳→加酶→调节pH→调节温度恒温水解→灭酶（100℃，5min）→调味→灌装→杀菌。

参照白振宇[1]的酶解工艺，略作修改。将一定量的脱脂牛乳加入到50mL烧杯中，用蒸馏水适当稀释，以5mol/L NaOH溶液调节pH至6.5在水浴锅中加热搅拌，加入木瓜、菠萝复合蛋白酶（酶与底物质量比为4%，复合比例1∶1），60℃保温水解3h，后加入胰蛋白酶（酶与底物质量比为5%），40℃水解3h。

1.2.2 微生物脱苦实验

1.2.2.1 乳酸菌脱苦实验 分别添加0.1%、0.5%、1%、2%、3%的直投式冻干乳酸菌于乳蛋白肽，于42℃培养5、7、9h，测定酶解脱苦后溶液的理化指标。

1.2.2.2 酵母菌脱苦实验 将酿酒酵母制成悬液，用划线分离法在平板上分离培养，经镜检确认纯化后，将酵母菌接种在含亚硒酸钠的斜面培养基上，活化2～3代。然后将斜面菌种接种到液体培养基中摇瓶培养。分别添加0.1%、0.5%、1%、2%、3%的酵母菌于乳蛋白肽，于42℃培养5、7、9h，测定酶解脱苦后溶液的理化指标。

1.2.2.3 复合菌脱苦实验 分别添加0.5%、1%、2%的复合菌（复合比例分别选择，乳酸菌∶酵母菌为2∶1，1∶1和1∶2），于42℃培养7h，考察乳酸菌、酵母菌复合的脱苦效果。

1.3 理化指标测定

1.3.1 总蛋白酶活力 取0.4mL酶液，加入2.0mL 1%的酪蛋白-PBS缓冲液（pH7.6），37℃温育10min后，立即加入10%三氯乙酸2.0mL，混匀、中止反应，4500×g离心20min，取上清液测275nm处吸光度值A。以空白生理盐水作对照。用酪氨酸标准物做酪氨酸标准曲线，利用吸光度A在标准曲线上求出蛋白酶释放出的酪氨酸浓度，从而推导出总蛋白酶活力。

总蛋白酶活力单位定义为：每克内容物37℃每分钟每增加1μmol酪氨酸为1个活力单位。总蛋白酶活力计算公式如下：

总蛋白酶活力（U/mL）=A×K×N×4/10

式中，A—样品平行实验的平均吸光度，K—当吸光度为1时的酪氨酸的量，μmol；N—酶液的稀释倍数；4—4mL反应液；10—反应时间10min。

1.3.2 短肽得率

1.3.2.1 可溶性氮的测定 将酶解液与质量分数20%的三氯乙酸以1∶1比例混合，4500r/min离心10min后取上清液采用Folin-酚法测定。

1.3.2.2 短肽得率的测定 三氯乙酸可溶性氮法[2]

式中，TCA-SNI—三氯乙酸可溶性氮，%；N1—在20%三氯乙酸中的可溶性氮，mg；N0—原料中总氮，mg。

原料中总氮的测定方法采用凯氏定氮法。

1.3.3 苦味值的测定 对脱苦处理前后短肽苦味的评价采用与未经脱苦处理的苦味短肽溶液相比对的方法：将未经脱苦处理的苦味短肽溶液的浓度分别配为20%、40%、60%、80%和100%（即未稀释），其苦味分别定级为1至5，感官品评小组以此标准评价脱苦后产品。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌脱苦效果

2.1.1 乳酸菌发酵对总蛋白酶活的影响 乳酸菌代谢产生的肽酶可水解疏水性氨基酸，从而起到脱苦的效果。乳酸菌接种量和培养时间对总蛋白酶活的影响见图1。由图1可以看出，乳酸菌培养时间由5h增加到7h，总蛋白酶活性明显提高；培养时间大于7h后，蛋白酶活增加不明显，后续实验选择培养7h。

由图1可以看出，乳酸菌接种量过低或过高，总蛋白酶活值都较低。乳酸菌接种量为0.5%时，总蛋白酶活最高，继续增加接种量，总蛋白酶活性降低，这是因为乳酸菌产生的其他蛋白酶和酶解产物进一步反应的结果[3]。

图1 乳酸菌接种量和培养时间对总蛋白酶活的影响Fig.1 Effect of lactobacillus inoculation and fermentation time on total protease activity

2.1.2 乳酸菌发酵对TCA-SNI和苦味值的影响 乳酸菌接种量对TCA-SNI和苦味值的影响见图2。由图2可以看出，随着乳酸菌添加量的增加，苦味值减小，添加量为0.5%～2%时苦味值最低，添加量2%～3%苦味值增大，这是因为接种量过大，乳酸菌产生的其他蛋白酶和酶解产物反应产生特殊苦味物质的结果。而添加量为0.1%～0.5%时，TCA-SNI随着添加量的增加而增大，在0.5%时TCA-SNI值最高，随后逐渐降低，这可能是因为生成的短肽被继续水解为游离氨基酸的结果，综合考虑0.5%的添加量较为适宜。

图2 乳酸菌接种量对TCA-SNI和苦味值的影响Fig.2 Effect of lactobacillus inoculation on TCA-SNI and bitter value

2.2 酵母菌脱苦效果

2.2.1 酵母菌发酵对总蛋白酶活的影响 酵母菌接种量和培养时间对总蛋白酶活的影响见图3。由图3可知，随着发酵培养时间的延长，总蛋白酶活逐渐增加，7h后趋于稳定。酵母菌接种量为0.1%时总蛋白酶活含量最低，增加接种量达0.5%时，总蛋白酶活达到较高水平，继续增加接种量，总蛋白酶活增加不明显甚至降低。结合图1、图3可知，酵母菌培养的总蛋白酶酶活明显高于乳酸菌。

图3 酵母菌接种量和培养时间对总蛋白酶活的影响Fig.3 Effect of yeasts inoculation and fermentation time on total protease activity

2.2.2 酵母菌发酵对TCA-SNI和苦味值的影响 酵母菌接种量对TCA-SNI和苦味值的影响见图4。由图4可知，随着添加量的增加，苦味值先降低后增加，在0.5%添加量时脱苦效果最佳，此时TCA-SNI也较高，随着发酵的进行TCA-SNI值先增加后缓慢下降。酿酒酵母的脱苦效果优于乳酸菌，这是由于乳酸菌代谢的肽酶属于胞内酶，而酿酒酵母菌在细胞壁存在若干种端肽酶[3]。

图4 酵母菌接种量对TCA-SNI和苦味值的影响Fig.4 Effect of yeasts inoculation on TCA-SNI and bitter value

2.3 复合菌脱苦效果

2.3.1 复合菌发酵对总蛋白酶活的影响 结果如图5所示，从图5中可以看出，两种菌有共生作用，混合培养产酶快；当添加量超过0.5%时，总蛋白酶活增加明显；继续增加添加量，总蛋白酶活增加不明显，这是因为接种量过大，菌体产生的其他蛋白酶增多并和酶解产物进一步反应。菌种的复合比例对总蛋白酶活的影响不大，复合菌接种量为1.0%时，总蛋白酶活最高达到32U/mL，这与曾少葵[4]的研究一致。

图5 不同添加量、复合比例对总蛋白酶活的影响Fig.5 Effect of inoculation and proportion of composite bacteria on total protease activity

2.3.2 复合菌发酵对TCA-SNI的影响 不同添加量、复合比例对TCA-SNI的影响见图6。由图6可以看出，乳酸菌、酵母菌的复合比例对TCA-SNI值的影响不大，其中酵母菌所占比例大，TCA-SNI值略有提高。添加量为1%时，TCA-SNI值较高，最大值达到34.5%。结合图2、图4可以看出，复合菌发酵的TCASNI值明显高于单独菌种发酵，这是由于酵母菌脱苦需和其他微生物联合使用，先用内切酶（乳酸菌）将完整的大蛋白分子水解成肽链，再用酵母菌产生的端肽酶将疏水性氨基酸残基切除，TCA-SNI值升高[5]。

图6 不同添加量、复合比例对TCA-SNI的影响Fig.6 Effect of inoculation and proportion of composite bacteria on TCA-SNI

2.3.3 复合菌发酵对苦味值的影响 由图7可以看出，两种菌复合后发酵苦味值较单一菌种发酵降低，改善了乳蛋白肽饮料的风味，混合菌种的脱苦效果好于单一菌种，1%复合菌接种量的脱苦效果好于0.5%和2%的复合菌接种量，苦味值为0.5。添加量1%～2%时，混合比例对乳蛋白肽饮料苦味影响不大；添加量0.5%时混合比例对乳蛋白肽饮料苦味有一定影响。

图7 不同添加量、复合比例对苦味值的影响Fig.7 Effect of inoculation and proportion of composite bacteria on bitter value

3 结论

乳酸菌、酵母菌均具有一定的脱苦效果，这是由于二者代谢产生的肽酶水解疏水性氨基酸的作用。实验结果表明，乳酸菌和酵母菌的复合菌按1%的添加量接种，TCA-SNI值较大，脱苦效果优于单一菌种的发酵效果。添加量1%～2%时，混合比例对乳蛋白肽饮料苦味影响不大；添加量0.5%时混合比例对乳蛋白肽饮料苦味有一定影响。

[1]白振宇.牛奶中主要过敏原的消除及检测技术的研究[D].天津：天津商业大学，2007：12-19.

[2]何慧，王进，裴凡，等.蛋白水解物与苦味的构效关系及脱苦研究[J].食品科学，2006，27（10）：571-574.

[3]孟雅潇.乳蛋白酶解肽苦味脱除工艺研究[D].北京：中国农业科学院，2008.

[4]孟雅潇，吕加平，周俊.乳蛋白肽微生物脱苦的研究概述[J].中国乳品工业，2008，36（3）：38-41.

[5]曾少葵，杨萍，陈秀红.微生物发酵对罗非鱼下脚料蛋白酶解液脱腥去苦效果比较[J].南方水产，2009，5（4）：58-63.