贾 晶 王振生 高宇辉 刘 娟 王 恒

(中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100005)

疟疾是世界上最严重的寄生原虫感染性疾病之一，一直以来都威胁着人类健康(WHO，2012)。随着分子生物学技术的不断发展，疟原虫的相关研究也日益深入，疟原虫基因及其编码蛋白功能的揭示为疟疾防治提供了新思路。由于鼠疟原虫基因改造技术的广泛推广及其完整生命周期分析的可实现性(Janseetal.，2011)，使得鼠疟原虫成为研究人类疟原虫使用最频繁的模式生物。近年来反向遗传学技术已经广泛应用于研究疟原虫基因功能及其与宿主间相互作用的分子机制(Carvalhoetal.，2005；Bauletal.，2007)。基因的靶向破坏成为深入研究疟原虫基因定位及其表达蛋白的功能的重要手段。而这些研究均以转染作为基础的应用技术之一。为保证转染的高效性，通常采用体外培养的方法可以使疟原虫发育至成熟裂殖体期后停止生长(Janseetal.，2006),从而获得大量成熟裂殖体，将其及发育完全的裂殖子作为质粒转染对象。但是传统方法培养时间长达20～22 h(陈俊等，2006)，期间对于培养环境要求苛刻，难以保持稳定。本文就伯氏疟原虫PbANKA1596cl1体外培养方法进行优化，为进一步提高鼠疟转染效率奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

伯氏疟原虫PlasmodiumbergheiANKA(PbANKA1596cl1，后文用Pb1596代替)由荷兰莱顿大学(Leiden University Medical Center，LUMC)Shahid Khan教授的疟疾研究课题组惠赠，为新型转染体系GIMO(Linetal.，2011)模式生物；6～8周龄的ICR小鼠(雌性，18～20 g,北京维通利华实验动物有限公司)、RPMI-1640细胞培养液(北京协和医学院细胞中心)、Nycodenz (Sigma)、各种型号离心管(BD公司)、细胞培养瓶(Corning, USA)、恒温培养箱(北京国光医化仪器厂)、显微镜(Olympus CH，Japan)、水平离心机(Eppendorf，Germany)。

1.2 实验方法

1.2.1虫株复苏：液氮中保存良好的伯氏疟原虫Pb1596，迅速置于37 ℃水浴，融化后移入15 mL离心管，逐滴加入0.2倍体积的12% NaCl与 9倍体积的1.6% NaCl洗涤细胞，2 000 r/min，3 min,弃上清；再用9倍体积的0.9% NaCl+0.2%葡萄糖洗涤细胞，2 000 r/min，3 min，弃上清；0.9% NaCl+0.2%葡萄糖溶液按照所用体积重悬下层细胞沉淀后，100 μL/只尾静脉注射入健康ICR小鼠体内。

1.2.2传代培养：经尾静脉接种的ICR小鼠，待原虫率达5%～15%，尾静脉取血2～4滴于400 μL枸橼酸钠PBS中, 混匀后以200 μL/只腹腔接种健康ICR小鼠2只 。

1.2.3原虫率计算：腹腔接种感染后每天固定时间小鼠尾部采血，血细胞涂片，甲醇固定，姬姆萨原液与水1∶6配制染液染色15 min后100×油镜观察。原虫率=感染红细胞数/所计数区域内全部红细胞总数。

1.2.4Pb1596体外培养：实验中为比较优化前后方法效果的不同，采用两种方法体外培养Pb1596，传统方法完全按照文献(Janseetal.，2006)操作；优化后的方法为：腹腔接种的小鼠4～5 d后，原虫率达5%～15%，且大部分原虫处于滋养体期。心脏穿刺取血用10倍体积的枸橼酸钠PBS混匀后1 600 r/min离心8 min，弃上清；细胞沉淀用10倍体积的完全培养基重悬后1 600 r/min离心8 min，弃上清；用7倍体积的完全培养基再次重悬细胞沉淀，并缓慢加入事先添加3 mL 55% Nycodenz工作液(55 mL Nycodenz 储存液/45 mL RPMI-1640)的离心管，1 600 r/min离心20 min。所需滋养体期感染红细胞位于中间层面，将其小心吸入50 mL离心管中，加入10倍体积的完全培养基，混匀后1 600 r/min离心8 min，弃上清； 1 mL完全培养基重悬沉淀，注入事先加入9 mL完全培养基的 25 cm2细胞培养瓶中，并在瓶中注入体积比为 5∶3∶92的CO2、O2和N2的混合气体30～60 s，迅速拧紧瓶口，37 ℃，40 r/min(细胞处于悬浮状态即可)低速振荡培养8～10 h。每种方法均使用购于同一公司的6～8周龄ICR小鼠1只，培养虫血体积均处于0.6～0.7 mL。

1.2.5细胞生长状态观察：体外培养相应时间后(传统方法：20～22 h，优化后：8～10 h)，取500 μL培养液，12 000 r/min急速离心10 s，弃上清，沉淀染色15 min，100×油镜观察细胞生长状态。

1.2.6同一生长周期内不同发育阶段疟原虫形态观察：在疟原虫一个生长周期内每隔2 h小鼠尾部采血显微镜观察计数不同发育阶段虫株所占比例。成熟裂殖体(%)=成熟裂殖体感染红细胞数/全部感染红细胞总数；滋养体(%)=滋养体感染红细胞数/全部感染红细胞总数。

1.2.7细胞存活率计算：细胞悬浮液适当倍数稀释，按照100∶1的比例台盼蓝染色，静置 1 min后活细胞计数。细胞存活率(%)=活细胞总数/总细胞数。

1.2.8数据分析：SPSS统计学软件，表1结果采用两独立样本t检验。

2 结果

2.1 伯氏疟原虫Pb1596生长趋势

观察正常情况下小鼠体内伯氏疟原虫Pb1596生长状态，绘制生长曲线如图1。正常情况下Pb1596感染的小鼠可存活1周，感染当天记为d0，第2 d记为d1，依次类推。感染后小鼠原虫率呈递增趋势，d3时达1%～3%，此时为传统体外培养方法采血最佳区间(Janseetal.，2006)；d4～d5升至5%～15%，此时小鼠及疟原虫状态良好，疟原虫生长处于对数期，是小鼠感染传代最佳区间，因此为保证体外短期培养细胞高存活率，并增大裂殖体比例，达到良好的培养效果，本实验中优化方法的采血时间定为此区间。

图1 伯氏疟原虫Pb1596生长曲线Fig.1 Growth curve of the Pb1596

图2 伯氏疟原虫Pb1596同一生长周期内发育特征Fig.2 Characteristics of Pb1596 in one growth cycle左侧Y轴：同一生长周期内不同期疟原虫感染红细胞所含百分比；右侧Y轴：同一生长周期内原虫率变化。Left Y-axis: the proportion of RBC infected by parasites at the different stage; Right Y-axis: the parasitemia in one growth cycle.

2.2 伯氏疟原虫Pb1596同一生长周期内发育特征

在保证小鼠正常生长状态下，体内伯氏疟原虫的生长周期为22～24 h(Janseetal.，2006)。同一生长周期内虫株发育特征如图2所示，同一周期内，成熟裂殖体感染红细胞所占比例处于相对稳定的状态，且均小于2.5%，不足以达到转染所需水平，相同时间点，滋养体感染红细胞比例达30%～55%，其比例远远高于同期裂殖体，将其富集后体外培养可以成为提高成熟裂殖体比

例的候选方法之一。

2.3 体外培养方法优化前后差异

在传统方法的基础上本实验从采血时原虫率、培养时间、培养体积等方面对伯氏疟原虫体外培养方法进行改进，如表1。采血原虫率的提高保证了滋养体较高的含量，缩短体外培养时间避免血细胞长时间处于体外不稳定生长环境，包括环境气体比例、pH等。因此,本实验优化后在保证细胞高存活率的同时缩短实验周期，使裂殖体保持良好发育状态，提高成熟裂殖体比例并增加单个裂殖体所含裂殖子数目，为进一步提高转染效率奠定良好基础。

2.4 体外培养方法优化前后虫株生长状态比较

两种方法实验前后虫株生长状态如图3所示，优化后成熟裂殖体比例显著增加，且有大量游离的发育完全的裂殖子，可被一同收集，充分利用，且单个裂殖体所含裂殖子数目增多，有助于提高转染成功率。

表1 两种方法培养伯氏疟原虫Pb1596的差异Tab.1 Differences about the Pb1596 culture conditions between the two methods

注：表中数据为3组独立重复实验平均值±标准差(SD)，*表示P<0.05。

Note: Data in the table are the averages of three sets of independent repeated experiments ±SD (*P<0.05).

图3 优化前后伯氏疟原虫Pb1596生长状态差异Fig.3 Growth status difference of the Pb1596 before and after optimizationA．传统方法体外培养前红细胞及疟原虫形态，箭头所指为感染红细胞，此时原虫率为1.86%；B.传统方法体外培养前红细胞及疟原虫形态，箭头所指也为感染红细胞，此时原虫率为11.22%；C.传统方法体外培养22 h后疟原虫形态，箭头所指为成熟裂殖体，圈中为游离裂殖子；D.优化方法体外培养9 h时后疟原虫形态，箭头所指为成熟裂殖体，圈中为游离裂殖子.A. Erythrocyte and the parasites before in vitro cultivation using the traditional method, arrow to infect red blood cells, the parasitemia is 1.86%; B. Erythrocyte and the parasites before in vitro cultivation using the improved method, arrow to infect red blood cells, the parasitemia is11.22%;C: Parasites after in vitro cultivation for 22 hours using the traditional method, arrow to mature schizonts and the cycle to the free merozoites; D. Parasites after in vitro cultivation for 9 hours using the improved method, arrow to mature schizonts and the cycle to the free merozoites.

3 讨论

转染技术的推广加快了反向遗传学技术的广泛应用，为实现其基因功能的研究带来新的曙光。将外源DNA导入寄生于红细胞的疟原虫细胞核，必须经过红细胞膜、纳虫空泡膜、疟原虫细胞膜和虫体细胞核膜4层膜，实际进入虫体核内的DNA大大减少。而只有当疟原虫处于成熟裂殖体及发育充分的裂殖子时才有利于外源DNA的进入，所以，成熟裂殖体比例对于疟原虫转染效率的影响十分重要。尽管通常采用的体外20～22 h培养方法转染效率已经优于之前的报道(van Dijketal.，1995；Menardetal., 1997)，但体外疟原虫培养环境中pH值、培养基能量供应及气体含量等条件要求苛刻，在整个培养过程中不易保持稳定，加大了操作难度。针对上述问题，本实验室对其体外培养方法进行优化，通过采集疟原虫生长至对数期的感染红细胞，离心富集滋养体期感染红细胞，体外短期培养8～10 h，提高了成熟裂殖体比例，增加单个裂殖体所含裂殖子数目，且缩短了实验周期。此外，传统方法的操作是在体外培养后梯度离心分离成熟裂殖体，此时游离裂殖子不能一同被收集，而本实验中先梯度分离再进行体外培养，最终将游离裂殖体一同收集，增加了裂殖子利用率。然而，本实验操作过程中出现细胞存活率小范围(<1%)下降现象，在今后的实验中从细胞与培养基比例，气体含量等方面仍有待改进。