付凤洋 陈 斌** 钟代斌 孟凤霞 闫振天 何正波 闫桂云

(1. 重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所，重庆 401331；2. College of Health Sciences, University of California at Irvine, CA 92697, USA; 3.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206)

中华按蚊Anophelessinensis是我国的主要传疟媒介之一(Chow, 1991; Liuetal., 2011)，媒介蚊虫的控制是预防疟疾传播的重要措施。目前，媒介蚊虫的控制主要通过使用杀虫剂浸泡蚊帐和室内滞留喷洒(WHO, 2009)。拟除虫菊酯因其对人低毒、灭虫效率高以及2～6个月的残效期在媒介蚊虫和农业害虫控制方面被广泛选择使用(WHO, 2005)。广泛大量地使用拟除虫菊酯增强了蚊虫抗药性的选择压力(Overgaardetal., 2005)。我国不同地区的蚊虫抗性监测数据显示，多种媒介蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂均产生了不同程度的抗药性(刘维德, 1990; 刘斯璐等, 2011)。了解蚊虫的杀虫剂抗性水平，研究其抗性机理对建立起可靠的抗性检测方法和有效的蚊虫监控十分必要。非洲传疟媒介冈比亚按蚊An.gambiae对拟除虫菊酯抗性已有了深入研究(Ransonetal., 2009；Kawadaetal., 2011)。研究表明，冈比亚按蚊para型钠离子通道基因的突变改变了神经系统对杀虫剂的敏感性从而产生对拟除虫菊酯的击倒抗性(Knockdown resistance,kdr) (Chenetal., 2008)。para型钠离子通道基因中多个位点的突变在多种按蚊中与拟除虫菊酯抗性有关，其中最常见的突变位于para型钠离子通道SII6片段的1014点位，被称为kdr基因(Kimetal., 2007; Singhetal., 2011)。

重庆地区20世纪80年代开始采用拟除虫菊酯类杀虫剂控制媒介蚊虫，对蚊媒传播疾病的控制发挥了巨大的作用。1992和2001年重庆市疾控中心对该地区疟疾传播媒介中华按蚊进行了抗性监测，监测结果显示该地区的中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂已经产生了抗药性(蒋诗国等, 1993; 蒋诗国等, 2002)。进一步开展重庆地区中华按蚊对拟除虫菊酯抗性水平检测，除虫菊酯类杀虫剂抗性与kdr基因突变关系的研究对弄清其抗性机理具有重要意义。我们在重庆市璧山和秀山县广泛采集了中华按蚊，结合实验室饲养品系，采用WHO标准区分剂量法检测了这两个县中华按蚊对溴氰菊酯的抗性水平；用PCR方法扩增和测序检测了kdr基因的突变，以了解目前重庆市中华按蚊对溴氰菊酯的抗性水平，及其抗药性与kdr基因突变的关系。

1 材料与方法

1.1 虫源

2011年7～9月在重庆市壁山县、秀山县各50个按蚊幼虫生长环境，分别采集按蚊幼虫1 000余头(图1)，用酵母与鱼食1∶1混合饲料将幼虫饲养至成虫。经形态学鉴定选取中华按蚊(陆宝麟等, 1997)，挑选雌性中华按蚊用10%葡萄糖水饲养3日后用于抗药性生物测定。中华按蚊敏感品系来源于江苏省，在重庆师范大学昆虫与分子生物学研究所建立实验室种群。

图1 重庆市采样地图Fig.1 Map of sampling sites in Chongqing, China1：璧山县；2：秀山县.1.Bishan County; 2. Xiushan County.

1.2 抗药性生物测定

使用WHO标准区分剂量法(WHO, 1998)，0.05%溴氰菊酯药膜由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所按照WHO推荐的方法制备(刘维德, 1979)。每个检测点测试100～110只蚊虫，同时设空白对照。室温25～27℃、相对湿度80%，药膜接触1 h分别记录接触10、15、20、30、40、50、60 min蚊虫击倒数，计算击倒率。以10%葡萄糖水恢复饲养24 h后检查死亡蚊数和存活蚊数，计算死亡率。并将生物测定后蚊虫记录存活状态单只无水乙醇保存。抗性判定标准：死亡率98%以上为敏感型(S)；死亡率80%～98%之间为初步抗性(M)；死亡率80%以下为抗性(R)。

1.3 DNA提取

生物测定后单只无水乙醇保存样本用Fast Tissue-to-PCR Kit (Fermentas) 分别提取基因组DNA。拔取蚊腿放入1.5 mL离心管中，加入50 μL组织裂解液和5 μL蛋白酶K，55℃ 孵育20 min，95℃ 孵育3 min，加入50 μL中和液漩涡振荡混匀。提取液14 000 r/min 离心5 min，将提取液保存于-80℃备用。

1.4 分子鉴定和kdr突变检测

野外形态鉴定为中华按蚊并作了生测的个体，在测序检测kdr突变前需作分子鉴定以确信是中华按蚊。只有被分子鉴定为中华按蚊的个体才用于结果分析。中华按蚊分子鉴定使用特异性引物扩增ITS2和28S rDNA区域(D1和D2) (Joshietal., 2010)。检测中华按蚊kdr突变，从NCBI下载中华按蚊para型Na+通道SII5-SII6片段的序列(DQ334052.1)，设计引物(Kdr-F: TGCCACTCCGTGTGTTTAGA和Kdr-R: GAGCGA TGATGATCCGAAAT)，PCR扩增kdr基因。PCR反应体系(总体积25 μL)为：模板(DNA提取液)8 μL，ddH2O 8.75 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 2 μL，MgCl21.5 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL，10 μmol/L引物(Kdr-F和Kdr-R)各1 μL。PCR反应条件：94℃ 3 min预变性；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察结果，送华大基因科技有限公司测序。

1.5 数据处理

测序结果使用EMBL-EBL在线工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_sixpack/)翻译其所编码的氨基酸序列，并利用BioEdit序列分析软件比对分析突变。使用JMP9.0 软件统计分析抗药性生物测试数据(溴氰菊酯60 min击倒率和致死率)以及kdr等位基因频率。使用VassarStats在线统计工具(http://vassarstats.net/index.html)采用卡方(χ2)检验中华按蚊的溴氰菊酯抗性和kdr突变的关联性。

2 结果

2.1 抗性水平

生物测定结果显示，璧山县中华按蚊首只击倒时间为31 min，在60 min内的击倒率为16.36%，恢复24 h后的校正死亡率为32.72%，为抗性种群；秀山县中华按蚊首只击倒时间为第37 min，击倒率为6.80%，校正死亡率为12.62%为抗性种群；实验室饲养品系首只击倒时间为8 min，击倒率为100%，校正死亡率为100%，为敏感种群(表1)。

表1 中华按蚊对溴氰菊酯的抗药性Tab.1 The bioassay of deltamethrin resistance in Anopheles sinensis

2.2 突变检测结果及其分析

PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳显示在DNA Marker的250和500 bp之间有1条带(图2)。璧山县样品检测76只，其中生物检测24 h恢复存活蚊40只，死亡蚊36只；秀山县样品检测43只，其中生物检测24 h恢复存活蚊30只，死亡蚊13只；实验室饲养品系样品检测15只，其中生物检测24 h恢复存活蚊0只，死亡蚊15只。

图2 中华按蚊kdr基因PCR扩增结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of kdr in An. sinensisM:DL2000;1：璧山县样本；2：秀山县样本；3：实验室种群样本.M:DL2000;1：Sample from Bishan County; 2: Sample from Xiushan County; 3:Sample from laboratory population.

测序结果显示，扩增所得片段大小为325 bp，将测序在NCBI上进行Blast搜索，与其相似度最高的是中华按蚊kdr基因，相似度达99%，证实所得序列为中华按蚊kdr基因。扩增序列推导出其蛋白质氨基酸序列73个氨基酸残基，与敏感性冈比亚按蚊、中华按蚊kdr基因氨基酸比对，在已报道的1014位点检测到突变。璧山县样品中检测到1种突变类型，由亮氨酸(L1014)改变为苯丙氨酸(L1014F)；秀山县样品中检测到2种突变类型，由亮氨酸(L1014L)改变为苯丙氨酸(L1014F)、半胱氨酸(L1014C)；实验室饲养品系样品中未检测到突变类型(图3)。查看测序峰图，璧山县L1014位点密码子存在野生型TTG纯合样本(TTG/TTG)、突变TTT纯合样本(TTT/TTT)以及杂合样本(TTG/TTT)；秀山县L1014位点密码子存在野生型TTG纯合样本(TTG/TTG)、突变TTT纯合样本(TTT/TTT)、TGT纯合样本(TGT/TGT)以及杂合样本(TTG/TTT)、(TTT/TGT)和(TTG/TGT)；实验室饲养品系全为野生型TTG纯合样本(TTG/TTG)。

璧山县群体基因突变频率较低，为7.23%， 而秀山县群体基因突变频率较高，为68.60%。璧山县群体存活蚊中野生型TTG等位基因频率为91.25%，突变型TTT等位基因频率为8.75%；死亡蚊中野生型TTG等位基因频率为94.44%，突变型TTT等位基因频率为5.56%。突变基因型TTT与抗药性性状间无关联(χ2=0.2，P=0.6547)。秀山县群体存活蚊野生型TTG等位基因频率为35.00%，突变型TTT+TGT等位基因频率为65.00%；死亡蚊中野生型TTG等位基因频率为23.08%，突变型TTT+TGT等位基因频率为76.92%。突变基因型TTT与TGT均与抗药性性状间无关联(TTT：χ2=0.30，P=0.4166；TGT：χ2=0.30，P= 0.3833)(表2)。

图3 kdr基因氨基酸序列对比Fig.3 The alignment of kdr amino acid sequences from different populations of An. sinensisAn. gambiae和An. sinensis的NCBI序列号分别为CAA73920.1和ABC60026.1。BS_1014L和BS_1014F：璧山县样品kdr基因氨基酸序列；XS_1014L、XS_1014F和XS_1014C：秀山县kdr基因样品氨基酸序列；LS_1014L：实验室饲养kdr基因氨基酸序列；□：kdr基因氨基酸序列L1014位点(Leu→Phe/Cys).The GenBank accession numbers for An. gambiae and An. sinensis are respectively CAA73920.1 and ABC60026.1. BS_1014L and BS_1014F: sequences from Bishan; XS_1014L, XS_1014F and XS_1014C: sequences from Xiushan; LS_1014L: sequence from laboratory population; □: L1014 site of the kdr gene whose mutation results in amino acid change from Leu (wild) to Phe/Cys.

采集点Study site存活状态Survival/Dead检测数NumberL1014位点等位基因频率(均值±标准误)L1014 site allele frequency(%±SE)TTGTTTTGT突变型等位基因频率 (%)Mutation site allele frequency (%)璧山县S4091.25±3.198.75±3.1908.75±3.19Bishan CountyD3694.44±3.295.56±3.2905.56±3.29秀山县S3035.00±4.8645.00±7.2720.00±5.6565.00±4.86Xiushan CountyD1323.08±9.7253.84±9.0023.08±9.7276.92±9.72

3 讨论

重庆市位于中国内陆西南部, 属亚热带季风性湿润气候，境内河流纵横交错，稻田星罗分布，气候地理条件特别适合蚊虫滋生繁殖。重庆市蚊虫种类有10属73种，能转播疾病的种类如中华按蚊、雷氏按蚊An.lesteri、致倦库蚊Culexpipiensquinquefasciatus、白纹伊蚊Aedesalbopictus等蚊虫都有广泛分布(季恒青等, 2009)。历史上重庆市是我国疟疾高发区，中华按蚊是主要的传播媒介之一(吴成果等, 2011)。70年代末引进的溴氰菊酯是目前杀虫活性最高的杀虫剂之一，具有高效、低毒、低残留、在人体内易生物降解等优点，广泛应用于媒介蚊虫的控制(Carfetal., 1990)。杀虫剂的持续使用，蚊虫不可避免的产生了抗性。蒋诗国等(1993)对重庆市的中华按蚊溴氰菊酯抗性水平首次进行检测，结果显示该地区的中华按蚊已具有初级抗性(死亡率：80.72%)。2001年再次检测该地区中华按蚊对溴氰菊酯的抗性水平，检测结果为抗性(死亡率：76.92%)(蒋诗国等, 2002)。本次检测结果：璧山县种群死亡率为32.72%，秀山县为12.62%。抗性水平进一步增加，这可能与公共卫生、农业等领域大量持续使用溴氰菊酯有关。有关卫生部门需注意采取有效措施，防止中华按蚊抗药性的进一步提高。

蚊虫对杀虫剂产生抗性的机制研究主要集中于代谢抗性和靶标位点抗性。拟除虫菊酯类杀虫剂主要靶标位点为para型钠离子通道，靶标位点突变引起其对杀虫剂产生抗击到抗性。目前，在对拟除虫菊酯已经产生抗性的冈比亚按蚊、阿拉伯按蚊An.arabiensis、库态按蚊An.culicifacies和斯氏按蚊An.stephensi检测发现，para型钠离子通道kdr基因第1014位密码子发生了突变，突变类型包括L1014F、L1014S和L1014C(Kimetal., 2007; Chenetal., 2008; Singhetal., 2011)。在河南、安徽等地的中华按蚊种群中，钠离子通道IIS6节段检测到了L1014F、L1014C等两种突变类型(武松等, 2010; 祁欣等, 2011; Tanetal., 2012b)，在我国广西省和越南的湄公河地区检测到L1014S突变类型(Tanetal., 2012a; Verhaeghenetal., 2010)。本研究对采自重庆的中华按蚊Na+通道IIS6节段进行PCR扩增，经序列比对发现有L1014F、L1014C两种突变类型，与安徽、河南等地中华按蚊的突变类型一致，未发现L1014S突变类型。河南、安徽等地的中华按蚊种群中没有发现野生型TTG，而采自璧山县的中华按蚊中野生型TTG纯合子比例达到90.78%，与安徽(16.35%～23.76%)(武松等, 2011)、河南(2.73%～4.90%)(祁欣等, 2011)等地报道中华按蚊生物检测击倒率无明显差异。

璧山县种群和秀山县种群基因突变与抗药性的关联分析结果未达显著水平。本次调查仅针对para型Na+通道IIS6节段的kdr基因，其他节段基因是否有突变以及对击倒抗性是否有影响有待进一步研究。