李晓华，杨晓潼，翟贵发，郭 利，王晓丽

(1中南民族大学生命科学学院，生物技术国家民委重点实验室，武汉430074;2湖北省襄阳市烟草专卖局，襄阳441003)

烟碱(Nicotine)是烟草生物碱中的主要成分，也是影响卷烟品质的重要因素之一［1］.目前，我国烤烟烟碱含量普遍偏高，尤其是上部烟叶，偏高的烟碱含量影响了烟叶质量和烟叶的工业可用性.故有效降低烟叶中烟碱含量成为烟草行业急需解决的问题.

目前国内多使用过滤嘴过滤、打孔稀释和烟草薄片等物理措施来降低烟碱含量，但会造成烟、香、气的损失.国外烟叶企业很早就已开始利用微生物发酵降解烟叶中的烟碱，既可降低烟碱含量又能改进卷烟品质，并满足消费群体对低烟碱卷烟的需求［2-7］.本研究从长期种植烟草的湖北襄阳土壤中分离烟碱降解菌，研究其降解性能，为微生物在烟草工业和环境保护的应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

土壤采自湖北省襄阳烟叶种植地，Nicotine(纯度≥98%)购自洛阳天科生物工程有限公司.烟碱培养基:13.3 g K2HPO4，4.0 g KH2PO4，0.1 g(NH4)2SO4，1.0 g 酵母粉，10.0 mL 微量元素(1.0 g MgSO4·7H2O，0.4 g MnSO4·H2O，0.2 g CaCl2·2H2O，0.2 g CuCl2·2H2O，0.02 gFeSO4·7H2O，用0.1 mol/L HCl溶解到100 mL)，加蒸馏水到1000 mL，自然 pH.培养基121℃高压蒸汽灭菌20 min后，加入一定量烟碱(用0.22 μm 滤膜过滤).烟碱分离培养基:在烟碱培养基中添加1.8%琼脂.种子培养基:10.0 g 胰化蛋白胨，5.0 g 酵母提取物，10.0 g NaCl，溶于900 mL去离子水，用2 mol/L的NaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至1000 mL.引物合成和测序由北京三博远志生物技术有限公司完成.

1.2 烟碱降解菌的筛选

取2.0 g土壤样品于20 mL烟碱培养基，30℃、180 r/min摇床培养.用0.9%生理盐水梯度稀释，涂布于烟碱分离培养基，于30℃培养，挑取菌株划线分离纯化.分别将纯化的菌株接入烟碱培养基中，于30℃、180 r/min摇床培养，测定发酵液中烟碱含量.

1.3 烟碱含量的测定

将分离纯化的菌株接入烟碱培养基中(烟碱质量浓度为1.0 g/L)，于30℃、180 r/min摇床培养，以未接菌的烟碱培养基为空白对照.发酵液于10000 r/min离心10 min，上清液用0.05 mol/L HCl溶液稀释至合适的吸光度范围.以0.05 mol/L HCl溶液为参比，测定发酵液在259 nm处的吸光值，计算烟碱降解率:烟碱降解率=(原培养液中烟碱含量–发酵液中烟碱含量)/原培养液中烟碱含量×100%.

1.4 菌种鉴定

参照文献［8］进行形态结构观察和生理生化特性鉴定.参照文献［9］提取细菌总DNA，测定16S rDNA序列.用于16S rDNA的PCR反应的引物为一对通 用 引 物，正 向 引 物 F1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和反向引物 F2:5'-AAGGAG-GTGATCCAGCC-3'.PCR 反 应 体 系(20μL):10×PCR 缓冲液 2μL，dNTP 1μL，F1 和 F2各1μL，模板 DNA 1μL，Taq 酶 0.25μL，超纯水 13.75μL.PCR 反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循环30 次;最后72℃延伸10 min.用 Blast在GenBank基因库中对测序结果进行同源性比较和鉴定.1.5 菌体生长量的测定

菌株以5%体积比的接种量接种至烟碱培养基中，在30℃、180 r/min条件下摇床培养，定时取样测定菌体的生长量和烟碱降解率，以分光光度法OD600表示.

2 结果与分析

2.1 烟碱降解菌的分离

测定分离所得到菌株摇瓶培养24 h后降解烟碱的能力，DAB2菌株烟碱降解结果见图1.如图1所示，烟碱培养基(CK)在259nm处有吸收峰，而经摇瓶培养24 h后的发酵上清液在259nm处吸收峰消失，表明DAB2菌株具有降解烟碱的能力.

图1 DAB2菌株发酵液和烟碱培养基紫外吸收图谱Fig.1 UV absorption spectrum of fermentation liquid by DAB2 strain and nicotine medium

2.2 DAB2菌株的鉴定

DAB2菌株显微观察和生理生化试验结果为:在烟碱固体培养基上菌落呈乳白色、圆形、光滑凸起、边缘整齐、不产色素，平板仍是淡黄色;在液体烟碱培养基中，发酵液颜色从原始澄清透明淡黄色逐渐变成深褐色.革兰氏染色阴性，伏-普试验、甲基红试验、吲哚试验呈阴性，硫化氢试验呈阳性.

图2为DAB2菌株系统发育进化树可以看出:DAB2菌株与中间苍白杆菌属(O.intermedium)分支较近(bootstrap值大于97%).结合生理生化特性，初步确定 DAB2菌株为中间苍白杆菌(O.intermedium).

图2 DAB2菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain DAB2

2.3 DAB2菌株的烟碱降解特性

DAB2菌株烟碱降解率与生长量的关系结果见图3.如图3所示，随着DAB2菌株的生长烟碱不断被降解，16 h时DAB2菌株生长量达到最大，此时烟碱的降解率达87.41%，这说明烟碱降解率和菌体生长量呈正相关.

图3 DAB2菌株的生长与烟碱降解Fig.3 The growth and degradation curve of strain DAB2

DAB2菌株以体积比5%的接种量分别接种到不同质量浓度的烟碱培养基中，30℃、180 r/min摇床培养，24 h取样测定菌株生长量和烟碱降解率，结果见表1.当培养基中烟碱质量浓度为1.0 g/L时，烟碱降解率为88.42%，生长旺盛;当培养基中烟碱质量浓度为3.0 g/L时，烟碱降解率为52.46%，生长受到一定程度抑制;当培养基中烟碱浓度高于6.0 g/L时，DAB2菌株生长和烟碱降解均呈下降趋势，烟碱降解率低于10.36%.

DAB2菌株以体积比5%的接种量接种到烟碱质量浓度为1 g/L的烟碱培养基中，于30℃、180 r/min摇床培养，每隔4 h取发酵液，在波长为200～400 nm条件进行紫外光扫描，结果见图4.如图4所示，0 h时培养基中存在大量烟碱，故259 nm有最大吸收峰，随着培养时间增加，259nm的特征吸收峰逐渐降低，即烟碱逐渐被DAB2菌株降解.当培养到8 h时，除 259 nm的特征吸收峰外，还在230nm、290nm处出现了2个新峰，推测是DAB2菌株代谢烟碱的中间产物.

表1 不同烟碱质量浓度对DAB2菌株烟碱降解率和生长量的影响Tab.1 Effect of nicotine concentration on growth and degradation of strain DAB2

图4 DAB2菌株不同时间发酵液紫外扫描图谱Fig.4 UV absorption spectrum of nicotine degradation by strain DAB2 at different time

3 结语

本研究从湖北省襄阳烟草种植地中分离得到一株烟碱降解菌，经形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列同源性分析，初步鉴定该菌株为中间苍白杆菌(O.intermedium).当烟碱质量浓度为1.0 g/L时，烟碱降解率为88.33%，生长旺盛;当烟碱质量浓度达到3.0 g/L时，烟碱降解率为52.46%，生长受到一定程度抑制;当培养基中烟碱浓度高于6.0 g/L时，DAB2菌株生长和烟碱降解均呈下降趋势，烟碱降解率低于10.36%.烟碱的耐受浓度在无机盐培养基中可达到6 g/L，比国内早期报道的中间苍白杆菌DN2［7］耐受能力更高.

在1 g/L烟碱浓度下，DAB2菌株的发酵上清液紫外扫描图谱显示:8 h时259 nm处波峰较4 h降低，并在230 nm和290 nm处出现了新峰，说明中间产物出现，12 h时新峰峰值达到最大，随后又逐渐降低，直到24 h所有峰值趋平.其降解途径和中间物还需进一步研究.

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