胡亚鹏，郭胜利

(1.陕西众兴高科生物科技有限公司，陕西杨凌712100;2.润盈生物(杨凌)有限公司，陕西杨凌712100)

泰乐菌素是一种畜、禽专用的大环内酯抗生素，其主要成份为泰乐菌素A，取代基不同会构成泰乐菌素B、C、D。其生产过程对工艺配方的要求较为严格，若配方不当可以影响其产生菌及合成前体物质各种酶的活性，使构成泰乐菌素的各前体浓度发生变化，从而会影响合成泰乐菌素的九步反应的条件、反应速度、转化方向、终产物的数量[1]。为提高泰乐菌素的产量。本文利用正交试验[2]确定了显著影响泰乐菌素产量的培养基因素，为泰乐菌素发酵配方优化提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 弗氏链霉菌(Streptomyces f radiae)，Eli Lilly and Company。

1.1.2 原材料 玉米淀粉，德州福源生物淀粉有限公司;酵母膏，北京双旋微生物培养基制品厂;玉米浆，华北制药康欣有限公司;豆饼粉、玉米蛋白，青岛天顺宇贸易有限公司;鱼粉，青岛昌盛饲料有限公司;豆油，西安邦琪油脂公司;CaCO3、MgSO4·7H2O、NaCl、KNO3、K2HPO4、FeSO4·7H2O。

1.1.3 仪器设备 LDZX-40CI 75L高压灭菌器、SW-CJ-2D超净工作台、LRH-250A生化培养箱、NRBP-207旋转摇瓶机、ScoutⅡ电子天平、OLYMPUS CX-41生物显微镜、梅特勒320 pH计、TU-1800紫外分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 培养条件 斜面培养:将保藏菌种孢子接入斜面培养基上，30℃恒温培养12 d。种子培养:将斜面菌种用接种铲接入50 mL种子培养基/500 mL三角瓶中。在30℃，180 r/min下培养2 d。发酵培养:将种子以10%接种量接入50 mL发酵培养基/500 mL三角瓶中在30℃，220 r/min下培养7 d。

1.2.2 试验方法

1.2.2.1 通过正交设计试验确定影响泰乐菌素发酵产量的显著培养料因素 影响泰乐菌素产量的因素较多:培养基起始pH值、鱼粉、玉米蛋白、K2HPO4和油。本试验结合公司生产自有配方选取三个主要发酵培养料鱼粉、玉米蛋白、豆油进行三因素三水平正交试验L9(34)(表1)，其他因素根据公司生产实际结合彭海萍等的试验结果[3]，确定培养基起始pH为7.20，K2HPO4为0.05%因素水平为不变量，通过直观分析和方差分析确定发酵培养料因素的显著性。

1.2.2.2 化学效价的测定 紫外分光光度计法测定化学效价，发酵液加硫酸铝助滤剂摇匀滤纸过滤，加0.1 mmol/L盐酸稀释，于290 nm处测定其OD值[4]。

表1 发酵培养料正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 发酵培养料正交试验结果 表2中试验处理数为9，实用列4列，其中第4列(D列)为空列，用以估计误差模型，数据重复次数为3。

表2 发酵培养料正交试验结果

2.2 直观分析 对表2试验结果进行直观分析，结果见表3。

表3 直观分析结果

由表3直观分析结果可见各因素作用的主次顺序为RA＞RB＞RC，即鱼粉＞玉米蛋白＞豆油。鱼粉和玉米蛋白随着加量的上升单位有所提高，豆油的变化对产量影响不大，由图1可见泰乐菌素发酵培养基的最佳配比为A3B3C2，即鱼粉1.92%，玉米蛋白0.87%，豆油4.8%。

图1 正交试验效应曲线图

2.3 方差分析 结果见表4。

表4 对正交结果的方差分析

从表4方差分析可以看出，鱼粉和玉米蛋白的F比均大于F0.05(2，2)，说明鱼粉和玉米蛋白为重要影响因素，对泰乐菌素发酵影响达到了显著水平。

通过以上正交试验得出，三个因素中鱼粉的影响尤为明显 F比 =83.025接近于 F0.01(2，2)=99.000，几乎达到极显著水平，突显了鱼粉对泰乐菌素发酵的重要性，与彭海萍等[3]以鱼粉、豆饼粉、卵磷脂、油等为主要原料，运用Plackett-Burmar方法设计试验同样筛选出鱼粉为重要影响因素的结果一致。

豆油F比＞F0.10(2，2)=9.000说明豆油因素水平的改变对发酵亦有一定的影响，这与彭海萍等[3]运用Plackett–Burmar分析的结果基本一致。油的使用在抗生素工业已有较长的历史，只作为一种优良的消泡剂而不作为碳源使用。近年来，有以油为碳源提高抗生素产量的研究报道[5]，与本试验结果相吻合。

3 结论

本试验对泰乐菌素发酵培养料鱼粉、玉米蛋白、豆油进行L9(34)正交试验，通过直观分析和方差分析得出，鱼粉和玉米蛋白的变化对发酵产量具有显著影响，豆油对发酵产量有一定的影响。鱼粉1.92%，玉米蛋白0.87%，豆油4.8%为发酵最优培养基组合，为下一步发酵罐小试提供了依据。此优化方法简单易行，可广泛用于培养基的筛选优化。

[1]郭胜利.一例泰乐菌素生产中配料错误的补救[J].中国兽药杂志，2010，44(2):59-60.

[2]李春喜，王志和，王文林.生物统计学[M].北京:科学出版社，2002.

[3]彭海萍，王 兰，曹 健，等.培养基成分对泰乐菌素产量的影响[J].粮食与饲料工业，2002，4:26-28.

[4]方晓梅，赵志甲，顾海科.泰乐菌素产生菌的空间诱变育种研究[J].航天医学与医学工程，2005，18(1):121-125.

[5]戚 薇.碳源对泰乐菌素产量的影响[J].天津轻工业学院学报，1999，6(1):41-44.