陈江燕，黄荣，陶颖，黄媛，罗英英，黄爱龙，胡接力

重庆医科大学 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016

乙型肝炎病毒 (HBV) 是一种重要的病原体，可导致一系列慢性肝病[1-2]。HBV为直径42 nm的球形颗粒[3]，呈双层壳结构，外壳主要由3种表面蛋白 (HBs) 构成[4]，内层核衣壳由核心蛋白 (HBc) 组成，为正20面体结构[5]，该结构包含90或120个HBc二聚体，每个二聚体由HBc单体通过二硫键连接[6-7]。HBc由4个α螺旋 (aa13-30，aa50-60-78，aa82-93-110，aa112-123-128) 和 C端精氨酸区组成[8]。第 2和第3个α螺旋转折形成钉状突起，aa80是尖突顶，位于核衣壳最表面 (图 1)[9-11]。HBc在HBV复制过程中必不可少，它所构成的核衣壳是包装前基因组 RNA (Pregenomic-RNA，pgRNA)和病毒聚合酶的场所[12]，另外，HBc还介导病毒基因组DNA进入细胞核，继而生成共价闭合环状 DNA (Covalently closed circled DNA，cccDNA)作为复制的初始模板[13]。

图1 HBc蛋白二维结构示意图[10]Fig. 1 Diagram of HBc structure[10]. (A) HBc monomer, aa78-82 is at the spike. (B) HBc dimer.

HBc因其作用重要，一直是HBV复制研究中的重要对象，然而，由于缺乏稳定且特性好的抗HBc抗体，很多研究不便开展。本研究针对这一问题，拟利用绿色荧光蛋白 (EGFP) 对HBc进行基因工程改造，试图达到以下目的：1) 能对 HBc表达情况进行监控；2)使得用免疫学方法检测 HBc以及捕获核心颗粒 (含有HBV基因组 DNA及聚合酶的核衣壳)成为可能；3)与此同时，不影响HBc自身功能，即经过改造的HBc仍能支持HBV复制。为达到以上目的，我们认为，EGFP标签需表达于核衣壳表面，以便被抗 EGFP抗体识别和捕获。从核衣壳的冷冻电镜结构[8]可知，位于其最表面的部分是HBc钉突部位 (aa78～82)，而不是C末端或N末端。因此，若在钉突位置插入EGFP，有可能使其暴露于核衣壳表面。但是，在一个蛋白的中间位置插入另一蛋白序列，有可能使这两种蛋白的三维结构都受到影响，不能正确折叠，从而影响甚至破坏二者的功能。Kratz等[14]的研究表明，对于截去C末端40 aa的HBc，当其钉突处aa79～80替换成GFP时，超过40%的融合GFP折叠正确，能产生绿色荧光，同时亦能形成与天然核衣壳类似的颗粒结构，然而，截去C末端的 HBc并不能支持 HBV复制[15]，我们在本研究中将以完整HBc为基础进行改造，考察这些融合蛋白是否保留了HBc的正常功能，同时，我们还探讨了不同类型接头以及不同大小插入片段对HBc蛋白功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒 pCH9/3091由第三军医大学西南医院感染病研究所兰林博士馈赠，德国 Nassal[16]课题组构建；HEK293细胞、质粒pEGFP-N1为本实验室保存；Southern blotting检测试剂盒、Xteme HP转染试剂购自罗氏公司；内切酶DpnⅠ购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 构建 HBV1.1c－质粒

采用不依赖酶切与连接的分子克隆方法(RLIC)[17-18]。以质粒pCH9/3091为模板，设计突变引物，使其HBc第40位氨基酸突变为终止密码，上游引物为：5'-GATACCGCCTCAG CTCTGTATCGGTAAGCCTTAGAGTCTCCTGA GCATTG-3'，下游引物为：5'-CTCGTCGTCT AACAACAGTAGTCT-3'，进行 PCR扩增。用QIAGEN 胶回收试剂盒回收扩增片段。回收片段带有突变碱基，作为大引物，用来替换模板质粒pCH9/3091中相应片段。反应体系：300 ng回收片段，50 ng pCH9/3091模板，0.5 μL PrimeSTAR 聚合酶等。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，18个循环。扩增产物用Roche PCR 产物纯化试剂盒纯化，取13 μL纯化产物用Dpn Ⅰ于37 ℃消化5 h，取2 μL消化后产物电转化JM109 感受态细胞，获得的克隆测序鉴定。

1.2.2 构建HBc质粒

以 pCH9/3091为模板，设计引物，上游引物为：5'-CAATCTCGGGAATCTCAATGTTAG GAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTAC-3'；下游引物为：5'-GTACAAAGACCTTTAACCTAAT CTCCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG-3'，作反向替换 (等同大片段缺失突变)，具体方法与前述类似。挑取克隆测序鉴定。

1.2.3 其他重组质粒的构建

将HBc aa79～80替换成EGFP有两种设计：1) HBc gfp-flex，由柔性接头连接EGFP两端并插入HBc中 (替换aa79～80)。首先以pEGFP-N1为模板，用引物FHBc gfp-flex1、RHBc gfp-flex1 PCR扩增，取0.1 μL扩增产物为模板，用引物FHBc gfp-flex2、RHBc gfp-flex2再次PCR扩增，得到两端加上柔性接头的 EGFP基因片段，其末端带有与 HBc aa79～80两侧序列同源的序列，然后以该片段为大引物，替换插入到 HBc中。方法类似 1.2.1。2)HBc gfp-heli，在 HBc gfp-flex基础上，EGFP两端各增加一段α螺旋的刚性接头，改变融合蛋白间的连接方式。构建方法大体与1)类似，但因该刚性接头序列较长且多重复碱基，难以直接用PCR将外侧序列加到上一轮PCR扩增片段两侧 (即heli2引物不能较好扩增heli1的扩增产物)，因此需在每轮扩增后，增加一次克隆过程，共进行了3次克隆。

此外，我们还在HBc gfp-flex基础上，将插入的外源片段逐步缩短，构建 3种重组质粒：1) HBc gfp15-flex，为HBc gfp-flex 删除EGFP中间部分，仅保留 EGFP15个氨基酸的重组HBc。2) HBc flex，在HBc gfp15-flex的基础上进一步将重组蛋白减短，融合多肽为2个G4S。3) HBc 7980-为第79、80位氨基酸缺失的HBc蛋白。均采用与RLIC原理相同的反向替换法。

1.2.4 HEK293细胞培养及转染

细胞培养及转染：HEK293细胞使用含10%胎牛血清的 DMEM培养基，于 37 ℃，含 5%CO2，相对湿度大于95%的无菌孵箱中培养。转染质粒前，先将细胞接种于 6 孔板，密度约为1.5×105个/孔，培养约 20 h，换新鲜培养基。配制转染体系：质粒与脂质体以1 : 3的比例混匀 (2 μg DNA : 6 μL 脂质体)，转染各孔，24 h后换液。继续培养4 d，收细胞。

表1 其他重组质粒构建所用引物Table 1 Primers used in the construction of other recombinants

1.2.5 Southern blotting检测HBV DNA复制中间体

细胞转染5 d后，提细胞内核心颗粒HBV DNA：用500 μL细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA，1% NP40，50 mmol/L NaCl，2%蔗糖)37 ℃孵育10 min，收集裂解物，15 000×g离心 4 min，取上清，加 5 μL 1 mol/L MgCl，50 U DNase I于 37 ℃孵育 5 h，加 200 μL沉淀剂(35% PEG 8000, 1.5 mol/L NaCl)，置冰上40 min，13 000×g离心10 min后弃去上清，再用Proteinase K消化过夜，经酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，将得到的产物溶于8 μL超纯水，用Southern blotting检测HBV DNA，具体操作步骤详见文献[19]。

2 结果

2.1 HBV1.1c-及HBc质粒的构建

构建HBc表达缺失的HBV 1.1倍体的目的，是为了后续检测各种经过改造的HBc是否保留正常功能，即支持HBV复制。我们在含1.1倍体 HBV基因组的 pCH9/3091基础上，将 HBc蛋白的第40个氨基酸突变成终止密码，同时不干扰HBV其他基因的表达[20](图2)。

图2 HBV1.1c－及HBc的构建及功能鉴定Fig. 2 Construction of HBV1.1c－ and HBc and functional characterization. (A)The principle of RLIC to delete a fragment from a plasmid. (B)Diagram of pCH9/3091, HBV1.1c－ and HBc. (C)Detection of HBV DNA by Southern blotting. M: marker; 1–4: HBV DNA extracted from HEK293 cells cotransfected with different clones of HBc and HBV1.1c－. 1: HBc1+HBV1.1c－4; 2: HBc1+HBV1.1c－5; 3: HBc3+HBV1.1c－4; 4: HBc3+HBV1.1c－5; 5 and 6:negative control (transfection only with HBV1.1c－4 or HBV1.1c－5). HBc1 and HBc3 are two different clones of HBc. HBV1.1c－4 and HBV1.1c－5 are two different clones of HBV1.1c－. ssDNA: single stranded DNA.

HBc质粒仅需带有 HBVc基因及转录终止信号，我们以pCH9/3091为基础，使用类似RLIC原理的方法 (图2)，具体为：设计一对完全互补的引物，引物两端序列分别与缺失目标序列两端同源，用该对引物进行替换反应，以去掉除了HBc及终止信号[21]以外的其他 HBV DNA。选择测序正确的HBc克隆质粒 HBc1、HBc3，分别与 HBV1.1c－克隆质粒HBV1.1c－4、HBV1.1c－5共转染HEK293细胞，对二者进行功能鉴定，二者具有正常功能的标准为：能支持 HBV复制。HBV复制中间体的Southern blotting 结果显示(图2)，HBc3 与HBV1.1c－4/5共转染后，可观察到复制中间体形成[22]，提示二者均保留了正常功能，支持HBV复制。

2.2 钉突部位融合EGFP的重组HBc功能鉴定

图3 HBc-EGFP的功能鉴定Fig. 3 Functional characterization of HBc-EGFP. (A)Structure of HBc, HBc gfp-flex and HBc gfp-heli. (B)Observation of green fluorescence in HEK293 cells transfected with different constructs (a, b: HBc gfp-flex; c, d:HBc gfp-heli). (C)Detection of HBV replication intermediates by Southern blotting: M: marker; 1: HBc+HBV1.1c－;2: HBc gfp-flex+HBV1.1c－; 3: HBc gfp-heli.+HBV1.1c－.

图4 HBc aa79～80短片段替换及缺失对其功能的影响Fig. 4 Impact of short insertion or deletion at aa79-80 of HBc on its function. (A) The structure and functional assay of HBc gfp15-flex. M: marker; 1: positive control HBc+HBV1.1c－; 2: HBc gfp15-flex+HBV1.1c－. (B) The structure and functional assay of HBc flex. (C)The structure and functional assay of HBc7980-.

在将HBc aa79-80替换成EGFP时，为了尽可能降低插入蛋白和本体蛋白在三维结构上的相互干扰，以减小对各自功能的影响，我们在插入位置设计了两种连接接头。一种是柔性接头，即在EGFP与HBc的两侧连接处，分别以多甘氨酸2G4S连接[14](HBc gfp-flex，图3)，另一种是柔性+刚性接头，即在2G4S与EGFP之间，分别增加一段可形成 α螺旋的序列 A(EAAAK)4A[23](HBc gfp-heli，图3)。测序正确的HBc gfp-flex/HBc gfp-heli重组质粒，分别与HBV1.1c－以1 : 1 (摩尔比)共转染 HEK293细胞，转染24 h后开始观测到荧光，随时间延长，荧光增强。图3所示为48 h的荧光情况。HBc gfp-flex产生的荧光蛋白在细胞内分布均匀，强度较转染 pEGFP-N1弱，提示受融合蛋白间的相互影响，正确折叠的EGFP减少。HBc gfp-heli产生的荧光表现不同，在细胞内呈现分散的点状荧光。

2.3 aa79-80位置短片段替换影响 HBc的正常功能

由于钉突部位融合EGFP的重组HBc可产生绿色荧光，但不支持HBV复制，提示尽管至少部分 EGFP可进行正确折叠 (正确的三维结构是其发荧光的前提)[24]，但至少部分HBc未获得正确折叠。我们接下来希望知道，是否是因为插入的EGFP片段过大，而影响了HBc的正常功能？为此，我们将插入片段逐步缩小，使替换的片段分别为EGFP的15个aa+柔性接头 (HBc gfp15-flex)，10aa柔性接头 (HBc flex)，以及仅缺失aa79～80(HBc 7980-)。将这些质粒分别与 HBV1.1c－共转染 HEK293细胞，然后提取细胞内核心颗粒DNA，Southern blotting检测HBV复制中间体。结果显示，这3种结构的质粒均未检测到病毒复制信号，而阳性对照 (野生型HBc+HBV1.1c－)可见明显复制。

3 讨论

HBc三维结构中的钉突部位 (aa78～82)位于核衣壳表面，其部位的抗原充分暴露，非常有利于与抗体结合，常作为植入外源抗原的部位[25]，但通常植入这些抗原的目的，是为了利用HBc可聚合成较大颗粒的特性，获得更好的免疫原性，并不关心是否保留HBc的主要功能，即支持 HBV复制。本研究旨在对 HBc钉突aa79～80处进行改造，插入标记蛋白EGFP，希望在对 HBc进行标记的同时，保留 HBc支持HBV复制的正常功能。

在本研究中，我们首先采用类似RLIC原理的大片段缺失方法，构建了一系列重组质粒，包括HBc及3种HBc-EGFP截短质粒。该方法利用同源序列退火和线性扩增，原理本质上仍是RLIC，区别只是用短的片段替换目标载体上较长的片段，而RLIC是用大的片段替换载体上的较短区域，结果一个是基因缺失，一个是基因插入。该方法使用时，对缺失片段大小及缺失位置无限制，本研究中的几种缺失片段大小为数百或数千bp，这些结果显示，RLIC是一种基因工程改造的有力工具。

我们在插入蛋白两端设计了两种连接接头，一种柔性接头和一种刚性接头。两种重组HBc转染HEK293细胞后均能发出绿色荧光，提示至少部分EGFP均获得了正确折叠。然而，两种 HBc-EGFP重组体所呈现的荧光表现明显不同，柔性接头连接者荧光均匀，而刚性接头者荧光呈分散点状，我们推测，导致荧光点状分布的原因可能有：1) HBc-EGFP分子间自发聚集成团，导致荧光成点状；2) 重组蛋白滞留在某种细胞器，不能进行正常运转。究竟何种机制导致这种表型尚待进一步研究，无论如何，这种表型的改变应该与刚性接头的加入有关。在对 HBc-EGFP的功能进行检测时，我们未能检测到病毒复制信号，可能的原因是融合的EGFP破坏了 HBc的正确结构，或者仅有少部分保留了正确结构而不足以被检测到。为了验证是否因为EGFP为较大的分子 (238 aa)而影响了HBc蛋白的结构与功能，我们缩短融合蛋白分子，其中一种仅为缺失aa79～80，发现这些分子仍不支持HBV复制，这提示aa79～80对于维持HBc的正常功能较为重要。Matthias等[26]证明，HBc蛋白缺失第80位氨基酸可支持HBV复制，因此我们认为aa79可能为HBc支持HBV复制不可缺失的氨基酸。

致谢 感谢美国 Drexel 大学医学院 Dr. Guo Haitao对本文的审阅。

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