王芝瑶，马玉彬，牟润芝，孙长江，张东远，王永飞

1 暨南大学生命科学技术学院生物工程学系，广东 广州 510632

2 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 生物燃料重点实验室，山东 青岛 266101

3 青岛首创瑞海水务有限公司，山东 青岛 266042

4 北京旭阳化工技术研究院有限公司，北京 100070

微藻由于生物质积累速度快，环境适应性强，含油量高，综合利用价值高，被认为是最有潜力的生物质能源原料之一[1]。微藻用于生产生物燃料的优势明显，但目前进行产业化生产还面临着巨大挑战，微藻生物燃料生产成本依然较高。生物燃料生产成本中的75%是原料成本[2]。从降低生物原料成本入手成为解决微藻生物燃料生产成本的重中之重。培育生物量积累速率快、油脂产率高的藻种，提供优质生物燃料原料，是降低微藻生物燃料生产成本的有效手段。

目前培育微藻新品种方法主要包括选择育种、诱变育种及基因工程育种。相对而言，诱变育种可以在短时间内获得大量优良突变体，较周期较长的选择育种优势明显，诱变会导致基因组水平突变，这种突变不容易丢失，较基因工程育种也具有一定的优势。近年来，重离子束特别是低能碳、氮离子束作为一种新兴的辐射源，由于其对微生物与植物种子有很强的致突变作用，已经在微生物及植物诱变育种研究中取得了巨大的经济与社会效益[3-4]。目前为止，这种高效的诱变方式尚未应用于产油微藻育种。

微拟球藻Nannochloropsis oceanica OZ-1是真核单细胞绿色微藻，直径为 2～3 μm，属于大眼藻纲，单珠藻科，其细胞内总脂含量可达干重的68%，是公认的最有希望用于工业化的高产油海水藻之一[5-9]。针对其产油特性育种的研究，目前仅有 1例使用甲基磺酸甲酯 (EMS)诱变提高其产油特性的报道[10]。本研究以微拟球藻为研究对象，采用重离子诱变方式进行育种，通过大规模筛选获得了两株高生长速率微拟球藻，随后对其生物量积累和产油特性进行分析。

1 材料与方法

1.1 藻种与培养

本实验藻种为美国马里兰大学Chen Feng教授惠赠的微拟球藻N. oceanica。培养液为BG-11海水培养基。培养条件为温度 (25±1)℃，光强为100 μmol/(m2·s)。

1.2 分析方法

1.2.1 重离子诱变与筛选方法

取生长至对数生长初期的野生型微拟球藻，测定细胞数目，稀释至 1.5×107个/mL。分别取藻液1.5 mL，置于无菌平皿中。后在中国科学院近代物理研究所重离子加速器垂直辐照终端装置下，用8×107eV/μ的碳离子束进行辐照，离子束传能线密度为31 keV/μm。将剂量范围设定为20 Gy、40 Gy、60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy、140 Gy和 160 Gy。通过平板培养与对照进行比较计算致死率。选取致死率在50%以上辐照条件下的2 000个藻株进行重点筛选。利用Imaging-PAM和酶标仪进行大规模筛选，在 24孔细胞培养板中培养，挑取最大光化学效率和 OD750值提高 10%以上菌株，最后经过50 mL、250 mL锥形瓶和400 mL鼓泡柱式光生物反应器反复验证最终确定诱变株系中生长迅速的两株突变藻株HP-1和HP-2。

1.2.2 细胞生长与干重测定

以处于对数生长期的突变株和野生株为种子液，接种于400 mL鼓泡柱式光生物反应器中，通入2% CO2进行培养。于培养的第0、2、4、6、8、10、12、16、18天取10 mL藻液，使用清洗好的醋酸纤维素膜 (孔径0.45 μm)抽滤，105 ℃烘至恒重后称重，测定干重，绘制生长曲线。

1.2.3 产油期生长曲线和总脂含量测定

采用两步法诱导产油，将处于对数生长后期野生型藻株和突变藻株HP-1、HP-2藻液，低速离心后，培养基更换为无氮海水BG11培养基，光照强度提高到300 μmol/(m2·s)，高光缺氮诱导产油。于产油期第0、3、5、7、9天取样测定产油期生长曲线，同时取50 mg野生型和突变株冻干藻粉，以氯仿-甲醇共溶剂提取，采用重量法测定总脂含量[11]。

2 结果与分析

2.1 微拟球藻重离子诱变和筛选方法建立

本研究选取产业化前景较好的微拟球藻为研究对象，进行重离子诱变育种。不同诱变剂量细胞致死率结果 (图 1)显示诱变剂量越高其细胞致死率越高。根据诱变经验，致死率大于50%时，产生突变的几率大。致死率为50%的辐照剂量为80 Gy，因此剂量在80 Gy以上辐照条件下的2 000个藻株作为重点筛选对象。随后利用叶绿素荧光仪和酶标仪进行大规模筛选，进一步反复验证获得两株高生长速率微拟球藻突变株 (HP-1和HP-2)。

2.2 突变株生长特性和油脂积累特性

随后对筛选获得的两株高生长速率突变藻株进行生长曲线测定，结果显示两株突变藻株生物量累积较野生型藻株高 (图2)，培养至第18天时较野生藻株分别提高18% (HP-1)和26% (HP-2)。

进一步对突变株产油期特性进行分析，结果显示突变株HP-1和HP-2产油期生物量积累较野生型藻株大幅提高，在培养末期突变株 HP-1和 HP-2生物量可以分别达到6.5 g/L和6.6 g/L，野生型藻株为5.6 g/L (图3A)。总脂含量突变株和野生藻株基本一致 (图3A)。根据生物量积累和总脂含量计算得到各藻株油脂产率，结果显示HP-1和HP-2突变株油脂产率较野生型大幅提高，突变株 HP-1和HP-2 可以分别达到 295 mg/(L·d)和 275 mg/(L·d)，而野生型为247 mg/(L·d)(图3B)。与已经报道的其他产油微藻油脂产率相比 (表 1)，本研究所获得的两株微拟球藻突变株优势明显。

图1 微拟球藻重离子诱变各辐照剂量细胞致死率Fig. 1 Mortality of N. oceanica treated with different dose of heavy-ion irradiation.

图2 微拟球藻野生型、突变株HP-1和HP-2生长曲线Fig. 2 Growth curve of N. oceanica wild type (WT), HP-1 and HP-2 mutant.

图3 微拟球藻野生型、突变株HP-1和HP-2产油期生长曲线 (实心标记)、总脂含量 (空心标记) (A) 和油脂产率(B)Fig. 3 Growth curve (filled marker), lipid content (empty marker)(A)and lipid productivity (B)of N. oceanica wild type (WT), HP-1 and HP-2 mutant during lipid accumulation phase.

高光缺氮诱导产油时，油脂大量积累，同时其生物量也相应提高，原因在于细胞内仍残存已经固定的氮源，细胞仍然可以生长，表现为细胞数量增多，细胞体积增大，最终导致生物量增加[12]。另外发现未高光缺氮诱导时细胞内也存在大量油脂，但此时油脂以极性脂为主，高光缺氮诱导后极性脂大量减少，中性脂大幅增加，最终油脂含量提高。

生物量积累和油脂产率是微藻产业化生产的重要评价指标，本研究所获得的两株微拟球藻突变株在生物量积累和油脂产率方面较野生型藻株具有明显优势，并且在获得突变株1年后优良性状仍未丢失，但是否可以作为未来产业化生产的优质藻种，还有待于室外大规模培养实验验证。

表1 微拟球藻突变藻株HP-1、HP-2和其他已经报道产油微藻油脂产率Table 1 Lipid productivity of N. oceanica HP-1, HP-2 and other microalgae species reported in the literature

3 结论

本研究以微拟球藻为研究对象，采用重离子诱变结合Imaging-PAM和酶标仪大规模筛选获得两株高产油突变株 (HP-1和 HP-2)，其主要优势在于生物量积累和油脂产率较野生型藻株高，是否产业化优势明显有待于室外大规模培养验证。

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