王立飞，孙 燕，刘清梅，李 治

（陝西师范大学 生命科学学院，陕西 西安710062）

烟碱型乙酰胆碱受体（Nicotinic Acetylcholine Receptor，nAChRs）是配体门控型离子通道受体，在动物的中枢神经系统中广泛存在，与学习、记忆、运动、注意力等重要功能密切相关［1］．乙酰胆碱（Acetylcholine，ACh）能激活突触前膜的nAChRs，引起Ca2＋流入前神经元的末端，导致神经递质的大量释放［2］．因此，nAChRs的激活改变了兴奋和抑制之间的平衡，促使神经兴奋［3］．依据前期的文献报道和研究结果，通过降低nAChR的水平或活性来维持类胆碱信号通路的相对平衡是十分重要的，并且可以避免应答过度激活的nAChR而导致的危害［4－6］．

LYNX 1属于Ly－6／neurotoxin超家族的成员，是一种nAChRs的调节剂［7］．作为内源性的原毒素，LYNX 1可以与nAChRs作用并改变其功能，从而调节nAChRs的活性，这对于整个类胆碱信号通路的调控有着重要作用［7－9］．LYNX 1在进化上类似于蛇毒素的前体，与α－和κ－环蛇毒素有着共同的结构特点．α－和κ－环蛇毒素可以与nAChR紧密结合从而抑制其活性．但与环蛇毒素不同的是LYNX 1并不抑制nAChRs的功能，而是降低了nAChRs对ACh的敏感程度［8］．另外，前期研究证实LYNX 1在体内是作为一种别构调节剂来调节nAChRs的活性，并且在中枢神经系统中维持神经元的活性和生存力［7，9－10］．此外，一 种新的Ly－6／neurotoxin超家族的成员LYNX 2也已经被发现［11］．

lynx1基因最早在小鼠体内被发现，并被认为是哺乳动物神经系统nAChRs的调节剂．随着基因测序和分子克隆技术的发展，已经在越来越多的物种体内发现了LYNX 1．2008年，Young Moo Choo等人在亚洲窗萤体内发现的类LYNX 1蛋白，并将其命名为Pr－lynx1，使得被证实含有lynx1基因的物种范围扩大到了无脊椎动物［12］．

三角涡虫（Dugesia）是扁形动物门的代表生物，在动物进化史上具有重要地位．涡虫具有原始的中枢神经系统，其神经细胞已趋于集中形成“脑”及由脑发出的纵向神经索，在纵神经索之间有发达的横行纤维相连，构成经典的梯式神经系统．涡虫的神经系统具有很强的再生能力．通过对大量EST的分析表明，涡虫体内上百种与神经系统相关的基因都与其他生物的同种基因保守度很高，包括人和小鼠．因此，对涡虫神经系统的研究已经成为神经发育学和再生医学等领域研究的热点．

本研究通过对东亚三角涡虫cDNA文库的筛选，获得一条功能未知的新基因Dj＿UF－1（Dujesia japonica Unknown Function Gene）；结合生物信息学分析和实验结果，推测Dj＿UF－1很有可能是东亚三角涡虫神经系统中一个类似于lynx1的重要基因．随着lynx1基因在更多物种体内被发现，必定会为这一神经系统重要分子的研究带来新的活力．

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．1．1 东亚三角涡虫 东亚三角涡虫在实验室条件下培养于水温为16℃的人造池塘水（Artificial Pond Water，APW，NaCl 6mmol／L，NaHCO30．1 mmol／L，CaCl20．6mmol／L，pH 7．3）中．每2d换水一次，每3d喂食新鲜猪肝一次．实验前一周停止喂食．

1．1．2 试剂 RNAiso Plus、M－MLV逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒、Real－time PCR试剂盒（SYBR Green）均购自TakaRa公司，无RNase的DNAase购自罗氏公司，DEPC购自Sigma公司．其他试剂均为国产分析纯．

1．2 方法

1．2．1 生物信息学分析Dj＿UF－1开放阅读框由ORF Finder预测（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．html）．利用blast（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）对Dj＿UF－1编码的氨基酸序列进行同源序列比对，同时用CLUSTALW2（http：／／www．ebi．ac．uk／Tools／clustalw2／index．html）进行氨基酸多序列比对，分析相似性．Dj＿UF－1蛋白质的理化性质、疏水性分析分别由ProtParam和ProtScal（http：／／web．expasy．org／protscale／）预测；蛋白质跨膜结构由TMHMM（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM／）预测；是否存在信号肽由SignalP 3．0（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP／）预测．用Phyre2（http：／／www．sbg．bio．ic．ac．uk／phyre2／html／page．cgi？id＝index）预测蛋白质的二级结构和三级结构．

1．2．2 Real－time PCR检测重金属离子胁迫对Dj＿UF－1基因表达的影响 用1．0mg／L CuSO4和1．0mg／L CdSO4溶液分别处理实验室条件下稳定培养的东亚三角涡虫，处理时间为1h、1．5h、2h，每0．5 h更换处理液1次．以APW水饲养的东亚三角涡虫为对照组．每组设3个平行．用Trizol法提取东亚三角涡虫总RNA．随后，总RNA经无RNase的DNAase于37℃孵育40min，去除基因组污染．经甲醛变性凝胶电泳检测后，取1μg总RNA逆转录获得一链cDNA．Real－time PCR反应体系参照试剂盒说明书（TaKaRa，大连）进行．所用Dj＿UF－1基因特异性引物为DjUF－1F：5′－ATTCATTAACGCAGCCACAT－3′和DjUF－1R：5′－ACCAACGACCTTCCTCTG－3′．同时以东亚三角涡虫β－actin基因作为Real－time PCR内参基因，引物分别为DLdjBTAF：5′－ACACCGTACCAATCTATG－3′和DLdjBTAR：5′－GTGAAACTGTAACCTCGT－3′．引物由南京金斯瑞生物有限公司合成．各基因扩增反应结束后继续从65℃升温至95℃（0．2℃／s），建立PCR产物的熔解曲线，检测熔链峰单一性．数据分析采用2－ΔΔCt方法．

1．2．3 Real－time PCR检测东亚三角涡虫不同部位Dj＿UF－1基因表达水平 将东亚三角涡虫用DEPC（Diethyl Pyrocarbonate）水冲洗干净，用灭菌手术刀片沿两侧耳突及眼点后方将涡虫切割成两段．将包含脑神经节的头部设为实验组，余下的尾部设为对照组，分别提取总RNA，每组设三个平行．Real－time PCR检测Dj＿UF－1基因在东亚三角涡虫头部和尾部的表达水平．具体条件同上．

1．2．4 数据统计分析 运用GraphPad Prism 5软件进行数据分析．实验数据采用方差分析进行显著性差异分析（P＜0．05表示有显著性差异）．

2 结果

2．1 Dj＿UF－1基因的生物信息学分析

图1 东亚三角涡虫Dj＿UF－1基因的生物信息学分析Fig．1 Bioinformatics analysis of Dj＿UF－1gene in Dujesia japonic

东亚三角涡虫Dj＿UF－1基因开放阅读框450 bp，编码149个氨基酸（图1a）．同源序列比对发现，Dj＿UF－1的氨基酸序列与曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）镉金属硫蛋白前体序列（XP＿002575981．1）同源性最高，相似度达到49．0，其他同源性较高的均为未知功能蛋白．Dj＿UF－1蛋白分子量为17179．8D，等电点为8．03；在整个氨基酸序列中，所占比例最高的3种氨基酸为异亮氨酸Ile（I）9．4%，亮氨酸Leu（L）7．4%，甘氨酸Gly（G）7．4%，均为脂肪族氨基酸；不稳定系数为36．24，说明该蛋白稳定［13］；全序列中脂肪族氨基酸42个，占氨基酸总数28．2%，脂肪族系数为83．29，总平均疏水指数为－0．007，说明该蛋白为亲水性蛋白．Dj＿UF－1蛋白亲疏水分值最大值为4．500，最小值为－2．500，整个氨基酸序列亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，但在氨基酸序列的C端和N端各有一个疏水性很强的区域［14］（图1b）．Dj＿UF－1蛋白的20位与21位氨基酸之间存在信号肽剪切位点，说明该蛋白N端具有一段信号肽序列（图1c）．Dj＿UF－1蛋白的N端（第3～21位）和C端（第125～145位）各有1个主要由脂肪族氨基酸组成的α－螺旋结构．两个α－螺旋结构之间有6个长短不等的β－折叠结构（图1d）．Dj＿UF－1蛋白氨基酸序列的第4～21位和第125～147位有两个跨膜的α－螺旋结构，22～124位的氨基酸序列位于膜内，其余的氨基酸序列位于膜外（图1e）．Dj＿UF－1蛋白与Ly6蛋白家族的LYNX 1蛋白在三级结构上的相似度非常高（图1f）．

2．2 重金属离子胁迫对Dj＿UF－1基因表达的影响

经1．0mg／L CuSO4溶液处理后，1、1．5、2h3个处理时间的Dj＿UF－1表达量与对照组相比均没有显著差异（图2a）．经1．0mg／L CdSO4溶液处理后，3个处理时间Dj＿UF－1表达量与对照组相比没有显著差异（图2b）．Dj＿UF－1基因表达水平在Cu2＋和Cd2＋胁迫下没有明显变化，说明重金属离子Cu2＋和Cd2＋对Dj＿UF－1基因的表达没有诱导作用．

图2 Cu2＋和Cd2＋处理东亚三角涡虫不同时间Dj＿UF－1的相对表达量Fig．2 The relative expression level of Dj＿UF－1gene in three different times treated with Cu2＋and Cd2＋

2．3 东亚三角涡虫不同部位Dj＿UF－1基因表达水平

将东亚三角涡虫沿两侧耳突及眼点后方切割成头部和尾部．Real－time PCR检测结果表明，Dj＿UF－1基因在东亚三角涡虫头部的表达水平明显高于其在尾部的表达水平（图3），具有显著性差异．

图3 亚三角涡虫Dj＿UF－1基因在不同部位的表达量Fig．3 The relative expression level of Dj＿UF－1 gene in different body parts

3 讨论

自1830年Duges首次发现涡虫（Planaria gonocephala）以来，这一扁形动物门的模式生物便受到了生物学家的广泛关注［15］．目前，有关涡虫基因组的研究取得了一定进展，地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）的基因组已经完成测序并建立了相应的基因组数据库．但其他物种，如东亚三角涡虫，基因数据信息还是零散的．同属扁形动物门的吸虫纲的基因组数据信息要丰富的多，因此涡虫基因组数据的进一步完善是十分必要的．与传统生物学实验相比，生物信息学分析可以快速得到未知基因的大量信息，为研究指明方向［16］．本研究利用生物信息学分析并辅以相关实验，对东亚三角涡虫未知基因Dj＿UF－1的功能进行了初步探究．

Dj＿UF－1氨基酸序列与曼氏血吸虫镉金属硫蛋白前体序列的相似度较高，推测Dj＿UF－1可能是东亚三角涡虫镉结合金属硫蛋白．金属硫蛋白（Metallothioneins，简称MTs）是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，与金属离子有很强的亲和力，普遍存在于各种生物体内，在重金属解毒和对抗氧化胁迫方面具有重要的作用［17－18］．前人研究表明，几种不同金属离子对MT基因的诱导能力为Cd2＋＞Cu2＋＞Hg2＋，因此本实验选取Cd2＋和Cu2＋对东亚三角涡虫进行处理，检测其对Dj＿UF－1的影响．然而，Real－time PCR结果显示Dj＿UF－1基因在Cd2＋和Cu2＋胁迫下表达水平没有明显变化，这一结果与金属硫蛋白的特性不符，提示Dj＿UF－1并不属于MTs家族．生物信息学可以对某一基因进行更深入的数据挖掘和分析，但其结果仍需要实验来验证。本研究通过重金属离子胁迫实验，证明Dj＿UF－1并不是金属硫蛋白基因，排除了生物信息学分析得出的这一可能结果．

进一步分析Dj＿UF－1蛋白的一级结构发现，半胱氨酸的含量仅为6．7%，脂肪族氨基酸的含量却高达28．2%．而大多数MTs的半胱氨酸含量很高，可达30%左右，但不含脂肪族氨基酸，如哺乳动物的MTs一般包含61～69个氨基酸，其中有20个左右的半胱氨酸，不含脂肪族氨基酸．多序列比对结果显示，Dj＿UF－1的149个氨基酸与曼氏血吸虫镉金属硫蛋白前体序列的226个氨基酸仅在N端（第5～103位氨基酸）相似度较高，而后者的半胱氨酸主要位于其C端（第122～216位氨基酸）．另一方面，同源性比对结果表明，除曼氏血吸虫镉金属硫蛋白前体序列之外，与Dj＿UF－1蛋白同源性较高的均为未知功能的蛋白．由此，我们推测Dj＿UF－1基因很有可能是一个功能未知的新基因．

蛋白质的生物学功能在很大程度上依赖于其空间结构，因而进行蛋白质高级结构预测对于探究未知蛋白质功能具有重要意义．通过对Dj＿UF－1蛋白高级结构进行生物信息学分析发现，Dj＿UF－1与Ly－6蛋白家族的LYNX 1蛋白的三级结构具有较高相似度．LYNX 1属于Ly－6／neurotoxin家族，通过糖基化的磷脂酰肌醇锚（GPI anchor）连接在细胞表面，并由8～10个保守的半胱氨酸形成特定的“三指结构”［8］．同属于“三指结构”蛋白的还有α－神经毒素．“三指结构”的最大特点是由四对二硫键形成一个球状的疏水核心，形状好似“手掌”，从疏水核心突出三个紧邻的富含β－折叠的环形成“手指”（loops I，II，III）．三根“手指”一般形成轻微的凹面，“三指”结构蛋白的功能性残基一般分布在这个凹面上．“三指”结构中第二根“手指”（loop II）对于蛋白与受体特异性结合具有重要作用［19，20］．另外，“三指”结构蛋白中β－折叠的含量一般较高，最高可达40%．本研究显示，Dj＿UF－1蛋白具有信号肽序列，且N端和C端各有一个长度约为20个氨基酸的α－螺旋结构，与LYNX 1一样属于跨膜蛋白．在Dj＿UF－1两个α－螺旋结构的中间有38个氨基酸形成6个β－折叠结构，占氨基酸总量的25%，含量较高，符合“三指”结构蛋白的特征．因此推测，Dj＿UF－1可能是类LYNX 1蛋白，Dj＿UF－1基因有可能是东亚三角涡虫神经系统的一个重要基因．

东亚三角涡虫的神经细胞向头部集中，已经具有原始的中枢神经系统．Dj＿UF－1基因在东亚三角涡虫头部的表达量显著高于其在尾部的表达量，提示Dj＿UF－1蛋白可能在东亚三角涡虫的神经系统中发挥功能．同时有研究指出，lynx1基因在脊椎动物脑部一些离散的神经元群体中高度表达．Dj＿UF－1蛋白与LYNX 1蛋白高水平表达部位的一致性，结合两者三级结构的相似性，提示Dj＿UF－1为类LYNX 1蛋白，Dj＿UF－1基因是东亚三角涡虫神经系统相关基因．

4 结论

本研究结合生物信息学分析及实验数据，研究了东亚三角涡虫新基因Dj＿UF－1的功能．初步证实Dj＿UF－1为类LYNX 1蛋白，Dj＿UF－1基因是东亚三角涡虫神经系统相关基因，为进一步探索该基因功能指明方向．Dj＿UF－1基因虽然在涡虫头部高表达，但是其表达部位是否与nAChRs的位置一致；Dj＿UF－1是否同LYNX 1一样，能与nAChRs结合并抑制其活性；如果Dj＿UF－1可以抑制nAChRs的活性，其机制是否与LYNX 1一致，这些问题还有待于后续实验的进一步研究证实，从而为Dj＿UF－1基因功能的研究和东亚三角涡虫基因组数据的完善提供理论依据．

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