夏慧芸，严向阳，王渭娜，宋莉芳

（1交通铺面材料教育部工程研究中心，长安大学 材料科学与工程学院，陕西 西安710061；2陕西师范大学 化学化工学院，陕西 西安710062）

蛋白质错误折叠和构象改变相关疾病已经引起人们的高度关注，例如阿尔茨海默、帕金森综合征、二型糖尿病等［1－8］，此类疾病都有着共同的特征：即在正常生理条件下，蛋白质或多肽二级结构由无规卷曲和α螺旋转变为更多的β折叠结构，自组装成直径大约5～10nm、长度处于亚微米级或微米级、无支链纤维状沉积物，统称为“淀粉样沉积”（Amyloid deposit）［9－12］．目前，淀粉样纤维形成的机制尚不清楚，然而大量研究表明，这一过程与自由基的产生有密切联系．自由基可以促进淀粉样沉积的聚集和纤维形成，同时在纤维形成的过程中也伴随有自由基产生，淀粉样沉积主要通过自由基发挥其强的神经毒性作用［13－17］．只要选用适当的抗氧化剂不仅可以抑制淀粉样纤维形成，而且还可以对抗淀粉样沉积的毒性作用，最终达到干预治疗的目的［18］．

多酚类天然抗氧化产物化合物具有极强的抗氧化和清除自由基的作用．虽然人们已经发现其能有效抑制淀粉样纤维的生成和细胞毒性，但是作用机理、构效关系仍不清楚，这种抑制作用的强弱表面上与抗氧化能力强弱有关，事实上与氧化产物的结构密切相关．本工作以体外小分子多酚化合物与淀粉样沉积相互作用的研究为模型，采用结构最简单的对苯二酚、对苯二醌作为还原型、氧化型多酚类物质的代表，从抑制纤维生长和逆转成熟纤维结构入手，借助多种表征方法，探讨氧化型／还原型的酚／醌类物质对抑制和逆转作用的关系，为多酚类化合物治疗淀粉样纤维相关疾病的药物筛选和设计有价值的实验依据．

1 实验

1．1 主要试剂与仪器

卵清溶菌酶购自Amersco公司；巯基硫黄素T（Th－t）购自Sigma公司；对苯二酚、对苯二醌等其他试剂均为分析纯；实验所用水为去离子二次蒸馏水，恒温水浴箱（江苏国华）；透射电子显微镜（JEM—2100，日本电子）；荧光分光光度计（LS—55，PE公司）．

1．2 对苯二酚和对苯二醌浓度的影响

纤维的制备参考文献［19，20］：称取10mg溶菌酶蛋白置于1．5mL Eppendorf管中，加入1mL HCl（10mmol／L，pH＝2．0），配制10mg／mL溶菌酶蛋白溶液，加入20μL 50mmol／L NaN3抑制菌类生长，密封，57℃孵育10d．

取20个1．5mL的Eppendorf管，2个试验组，每组10个，各含有1mL 10mg／mL溶菌酶蛋白，第一个试验组中依次分别加入终浓度为0、0．02、0．05、0．08、0．1、0．4、0．8、1．0、1．5、2mmol／L的对苯二酚；第二个试验组中依次分别加入终浓度为0、0．02、0．05、0．08、0．1、0．4、0．8、1．0、1．5、2mmol／L的对苯二醌．摇匀，密封，570C恒温孵育10d．用Th－t荧光探针检测各浓度对淀粉样纤维最终的生长抑制程度，最终的形貌通过透射电子显微镜来表征．

1．3 对苯二酚及对苯二醌的影响

用HCl（10mmol／L，pH＝2．0），将对苯二酚﹑苯二醌分别配置成10mmol／L（终浓度0．5mmol／L）的溶液，现配现用．

取2个5mL Eppendorf管，各加入400μL（10 mg／mL）成熟纤维，分别加入50μL 10mmol／L对苯二酚和对苯二醌（终浓度为0．5mmol／L），各加入50mmol／L pH＝7．4的磷酸盐缓冲液至2mL，摇匀，密封，置于37℃恒温孵育6d，第2天和第6天各取样50μL用于表征．

1．4 孵育时间以及pH值的影响

取2个5mL Eppendorf管，各加入400μL（10mg／mL）成熟纤维，分别加入50μL终浓度为0．5mmol／L对苯二酚和对苯二醌，各加入50 mmol／L pH＝7．4的磷酸盐缓冲液至2mL，摇匀，置于37℃恒温孵育10d，每两天取样50μL进行检测．

1．5 Th－t荧光检测

不同浓度的对苯二酚和对苯二醌对溶菌酶淀粉样纤维形成的结果检测：取50μL样品，加入3mL 50mmol／L pH＝8．0Tris－HCl，加入20μLTh－t（终浓度20μmol／L），440nm激发，狭缝宽度10nm，检测482nm处荧光强度［21－22］．

对苯二酚、对苯二醌对成熟纤维逆转的结果检测：取50μL样品，加入3mL 50mmol／L pH＝8．0 Tris－HCl，加入20μL Th－t，440nm激发，狭缝宽度10nm，扫谱．

1．6 TEM表征

样品稀释至1mg／mL，取10μL滴于铜网上，用2%的磷钨酸负染5min，在空气中自然晾干，然后观察．

1．7 对苯二酚对苯二醌量化计算

工作采用Gaussian03程序，用B3LYP方法在6－311＋＋g的水平上，对对苯二醌和对苯二酚化合物进行计算，得到分子的电荷、分子轨道、偶极矩等信息．

2 结果与讨论

2．1 不同浓度对苯二酚和对苯二醌对溶菌酶淀粉样纤维形成的影响

图1为溶菌酶淀粉样溶液中加入不同浓度对苯二酚和对苯二醌时检测的Th－t荧光强度的变化．从图中可看出，当对苯二酚和对苯二醌最终浓度为从0变化到1．0mmol／L时，Th－t荧光强度都随浓度逐渐增大而降低，但降低幅度不同．这表明对苯二酚和对苯二醌对溶菌酶淀粉样纤维生长都具有一定的抑制作用，但抑制程度（效率）不同，主要表现为最小有效抑制浓度不同：即对苯二酚为1．0mmol／L；对苯二醌为0．4mmol／L，这一结果说明对苯二醌对溶菌酶淀粉样纤维的抑制作用强于对苯二酚．

图1 不同浓度对苯二酚和对苯二醌对溶菌酶纤维生长抑制作用Fig．1 Inhibition of p－hydroquinone and p－benzoquinone with different concentrations to the formation of lysozyme amyloid fibril

通过透射电子显微镜也观察到对苯二酚和对苯二醌对溶菌酶淀粉样纤维不同的抑制作用，如图2所示．A图是典型的淀粉样纤维形貌，当加入1．0 mmol／L对苯二酚和0．4mmol／L对苯二醌时，溶菌酶淀粉样纤维的生长已经完全抑制，无明显的纤维形状，变成无规聚集体（图C，D）．当对苯二酚浓度为0．4mmol／L时（B），没有完全抑制淀粉样纤维的生长，仍然能够看到纤维状物质，只是密度变得没有空白对照密集，结果与荧光检测相同，对苯二醌抑制作用强于对苯二酚．

图2 不同浓度对苯二酚及对苯二醌对溶菌酶纤维化作用的TEM照片Fig．2 TEM images of hydroquinone lysozyme amlyoid fibril in presence of p－hydroquinone and p－benzoquinone with different concentration

2．2 对苯二酚、对苯二醌对成熟纤维的影响

人们已经发现多种成熟淀粉样纤维对机体细胞产生毒性，因此我们探讨了对苯二酚﹑对苯二醌对成熟纤维结构的影响．成熟纤维在pH＝7．4的磷酸盐缓冲液中，分别与0．5mmol／L对苯二酚﹑对苯二醌37℃孵育10d的条件下，通过Th－t荧光检测对成熟纤维结构影响，结果如图3和图4．Th－t荧光检测在482nm处荧强度随着孵育时间的延长逐渐减弱，说明淀粉样纤维的结构由规则的β－sheet转变为α－helix，两者都可以对成熟纤维结构起到逆转作用．但是对苯二醌的荧光强度下降趋势要明显快于对苯二酚，对苯二酚荧光强度下降趋势比较缓和，表明在pH＝7．4的磷酸盐缓冲液中，对苯二醌的逆转作用强于对苯二酚．

图3 对苯二酚存在时随孵育时间变化的疏基硫黄素T荧光光谱Fig．3 Fluorescence spectra of Th－t with time for the system of lysozyme amlyoid fibril in presence of p－hydroquinone

图4 对苯二醌存在时随孵育时间变化的巯基硫黄素T荧光光谱Fig．4 Fluorescence spectra of Th－t with time for the system of lysozyme amlyoid fibril in presence of p－benzoquinone

通过透射电子显微镜也可以看到对苯二酚和对苯二醌对成熟纤维的逆转作用，结果如图5．通过6 d的孵育，都已经没有纤维状形貌（图5A，B），变成无规聚集体，这种结构的变化可以有效地降低成熟纤维对机体细胞的毒性［23］．

图5 对苯二酚（A）和对苯二醌（B）逆转成熟纤维的TEM照片Fig．5 TEM images of mature fiber reversed in presence of p－hydroquinone（A）and p－benzoquinone（B）

为了考察pH值对成熟纤维逆转的影响，进一步将磷酸盐缓冲液介质pH控制为6．5，对苯二酚和对苯二醌最终浓度仍然保持为0．5mmol／L时，考察其对成熟纤维的影响，结果见图6．从图可看出，在偏酸性环境中，对苯二醌对成熟纤维基本无作用，对苯二酚却有明显的逆转效果．这一结果表明，在偏酸性条件下对苯二酚的逆转作用强于对苯二醌，与上述讨论结果恰恰相反．

图6 对苯二酚、对苯二醌存在时孵育时间变化的巯基硫黄素T荧光光谱Fig．6 Fluorescence spectra of Th－t for the system of lysozeme amlyoid fibril in presence of p－hydroquinone or p－benzoquinone

2．3 量化计算结果

通过Gaussian 03软件对对苯二酚和对苯二醌的有效电荷、HOMO、LOMO进行计算（6－311＋＋g水平优化），结果如表1．分子的净电荷反映了分子间静电吸引的能力，最低空轨道能量越低，越容易接受电子，最高占有轨道能量越高越容易提供电子，故分子的前线轨道反映了形成分子间氢键的能力．由此看来，与对苯二酚相比，对苯二醌具有较大的静电吸引的能力和成分子间氢键的能力，在高温（56℃）孵育条件下，介质的质子化作用相对比较弱，因此即使在pH＝2的生长环境中，对苯二醌的抑制能力仍然强于对苯二酚，也就是说对苯二醌结合蛋白的能力强于对苯二酚，在弱碱性环境中的逆转，溶剂质子化可以忽略，同样对苯二醌强于对苯二酚，但是在温度较为温和的弱酸性环境中（37℃），出现相反结果的原因就是对苯二醌自身对溶剂质子化作用占据主导地位，导致对苯二醌本身量化参数的改变，自身的质子化降低了与蛋白质的进一步相互作用，从而逆转效果不如对苯二酚．

3 结论

对苯二酚﹑对苯二醌小分子化合物对溶菌酶淀粉样纤维的形成有抑制作用，在弱碱性环境中对成熟纤维有结构逆转的作用，而且还原型对苯二醌作用强于氧化型对苯二酚，但是在弱酸性环境中，由于溶剂质子化作用，对苯二醌的逆转效率低于对苯二酚．对苯二酚可以很容易转化成对苯二醌，醌式结构强于酚式结构，这对设计药物有很大的指导意义；同时引入量化计算，结合这对氧化还原型小分子，对复杂天然产物抑制淀粉样纤维疾病的差异在一定程度上可给予解释．

［1］Obici L，Perfetti V，Palladini G，et al．Clinical aspects of systemic amyloid diseases［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2005，1753（1）：11－22．

［2］Koo E H，Lansbury P T J，Kelly J W．Amyloid diseases：abnormal protein aggregation in neurodegeneration［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1999，96（18）：9989－9990．

［3］Makin O S，Serpell L C．Structures for amyloid fibrils［J］．FEBS Journal，2005，272（23）：5950－5961．

［4］Clark K，Nilsson M R．Islet amyloid：a complication of islet dysfunction or an aetiological factor in type 2diabetes［J］．Diabetologia，2004，47（2）：157－169．

［5］曹傲能，汪蔚学，宇文泰然，等．小热休克蛋白MjHSP16．5对多肽纤维生长的抑制及对成熟纤维的解聚作用［J］．物理化学学报，2010，26（7）：2015－2020．

［6］Armen R S，Daggett V．Characterization of two distinct β2－microglobulin unfolding intermediates that may lead to amyloid fibrils of different morphology［J］．Biochemistry，2005，44（49）：16098－16107．

［7］Hong D P，Fink A L．Independent heterologous fibrillation of insulin and its B－chain peptide［J］．Biochemistry，2005，44（50）：16701－16709．

［8］Poirier M A，Li H，Macosko J，et al．Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization［J］．Journal of Biological Chemistry，2002，277（43）：41032－41037．

［9］Kakuyama H，S derberg L，Horigome K，et al．CLAC binds to aggregated abeta and abeta fragments，and attenuates fibril elongation［J］．Biochemistry，2005，44（47）：15602－15609．

［10］Dobson C M．The structural basis of protein folding and its links with human disease［J］．Philosophical Transactions of the Royal Society B：Biological sciences，2001，356（1406）：133－145．

［11］Sato T，Kienlen－Campard P，Ahmed M，et al．Inhibitors of amyloid toxicity based on beta－sheet packing of A beta 40and A beta 42［J］．Biochemistry，2006，45（17）：5503－5516．

［12］Cohen T，Frydman－Marom A，Rechter M，et al．Inhibition of amyloid fibril formation and cytotoxicity byhydroxyindole derivatives［J］．Biochemistry，2006，45（15）：4727－4735．

［13］Karsai A，Nagy A，Kengyel A，et al．Effect of lysine－28side－chain acetylation on the nanomechanical behavior of alzheimer amyloid beta25－35fibrils［J］．Journal of Chemical Information and Modeling，2005，45（6）：1641－1646．

［14］Dyrks T E，Dyrks T，Hartmann C，et al．Amyloidogenicity of beta A4and beta A4－bearing amyloid protein precursor fragment s by met a－l catalyzed oxidation［J］．Journal of Biological Chemistry，1992，267（25）：18210－18217．

［15］Butterfield D A，Hensley K，Harris M，et al．B－amyloid peptide free radical fragmnts initiate snaptosomal lipoperoxidat ion in a sequence－specific fashion：implicat ions to Alzheimer disease［J］．Biochemical and Biophysical Research Communications，1994，200（2）：710－715．

［16］Hensley K，Carney J M，Mattson M P，et al．A model for B－amyloid aggregate ion and neurotoxicity based on free radical generation by the peptide：relevance to Alzheimer disease［J］．Proceedings of the National A－cademy of Sciences，1994，91（8）：3270－3274．

［17］庾照学，汪华侨，袁群芳，等．抗氧化剂TA9901抑制加速老化鼠脑淀粉样颗粒的沉积［J］．解剖学报，2002，30（1）：28－32．

［18］姚志彬．以Aβ为靶的老年性痴呆的治疗策略［M］∥陈可冀．老年性痴呆发病机理与诊治．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：227－228．

［19］He Jing，Xing Yanfei，Huang Bo，et al．Tea catechins induced the conversion of preformed lysozyme amyloid fibrils to amorphous aggregates［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（23）：11391－11396．

［20］Arnaudov L N，De V R．Thermally induced fibrillar aggregation of hen egg white lysozyme［J］．Biophysical Journal，2005，88（1）：515－526．

［21］Frare E，Polverino D L P，Zurdo J，et al．A highly amyloidogenic region of hen lysozyme［J］．Journal of Molecular Biology，2004，340（5）：1153－1165．

［22］Levine H．Thioflavine T interaction with synthetic alzheimer′s disease detection of amyloid aggregation in solution［J］．Protein Science，1993，2（3）：404－410．

［23］Nilsson M R．Techniques to study amyloid fibril formation in vitro［J］．Methods，2004，340（1）：151－160．